7 10 18a 20a 21 23a 23b 24 25a 25b
3.4.3. Các đặc điểm sinh học của chủng M
Đặc điểm hình thái.
Chủng M37 có tế bào hình cầu khơng chuẩn, kích thước thay đổi theo thời gian sinh trưởng, cấu trúc hiển vi có hiện tượng tế bào cụm thành nhóm đơi, ba hoặc nhiều hơn (Hình 3.10A). Trên kính hiển vi điện tử quét, tế bào của chủng này có bề mặt khơng trơn nhẵn, khơng có roi và tiêm mao, hình cầu khơng chuẩn với đường kính 1 – 5 m (Hình 3.10C). Trên kính hiển vi huỳnh quang, tế bào của chủng M37 có phát sáng nhưng khơng mạnh (Hình 3.10B).
Phân tích so sánh trình tự 16S rDNA cho thấy chủng M37 thuộc chi
Methanosarcina, loài gần gũi nhất là M. siciliae với độ tương đồng là 98%
(Hình 3.10D). Trình tự gen 16S rDNA của chủng M37 được lưu tại ngân hàng dữ liệu GenBank với mã số KC951109. Chủng M37 được đặt tên là
Methanosarcina sp. M37 và được lưu tại bảo tàng giống chuẩn Việt Nam với
Hình 3.10. Hình thái tế bào và cây phát sinh chủng loại của chủng M37.
A, B, C – Hình thái tế bào dưới kính hiển vi phản pha, kính huỳnh quang (bar = 5 m), kính hiển vi điện tử quét (bar = 2 m); D – Vị trí chủng M37 so với các lồi có quan hệ kính hiển vi điện tử quét (bar = 2 m); D – Vị trí chủng M37 so với các lồi có quan hệ
gần gũi dựa trên so sánh trình tự 16S rDNA.
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Sinh trưởng của chủng M37 phụ thuộc các điều kiện nhiệt độ, pH và độ
muối khác nhau được tiến hành trên mơi trường khống dịch thể kỵ khí với cơ chất là hỗn hợp Na-acetate, methanol và trimethylamine (10 mM mỗi loại), kết quả được đánh giá thông qua giá trị đo mật độ quang của dịch ni (OD600) và lượng methane sinh ra (lượng khí tính theo mol ở điều kiện tiêu chuẩn) (Hình 3.11).
D
C
Hình 3.11. Ảnh hưởng của điều kiện mơi trường nuôi cấy đến mức tăng trưởng và sinh
methane ở chủng M37. A - Ảnh hưởng của nhiệt độ; B - Ảnh hưởng của pH; C - Ảnh hưởng của độ mặn (áp suất thẩm thấu). Thí nghiệm A và C được tiến hành ở bình serum thể tích 100 ml; thí nghiệm B được tiến hành ở ống nghiệm thể tích 20 ml nên có sự khác
biệt về lượng methane tích lũy được.
CH 4 (m ol) Nhiệt độ(C) A CH 4 (m ol ) pH B CH 4 (m ol ) Nồng độ NaCl (g/L) C
Kết quả cho thấy chủng này thuộc nhóm VSVSMT ưa ấm và có khả năng chịu nhiệt nhẹ (Hình 3.11A). Chủng M37 sinh trưởng tăng sinh cũng như tạo methane tốt nhất ở nhiệt độ 37C. Sinh trưởng và tạo methane vẫn tiếp tục ở nhiệt độ 45C nhưng ở mức thấp hơn, trong khi đó ở 30C thì chỉ có sinh trưởng nhưng ít tạo methane, cịn ở 20C thì sinh trưởng rất kém. Kết quả này cũng phù hợp với những công bố trước đây đối với các chủng VSVSMT khác cũng thuộc loài M. siciliae (Ni et al, 1994; Elberson và
Sowers, 1997).
Chủng M37 có khả năng sinh trưởng và tạo methane trong khoảng pH rộng, từ 5,5 ÷ 8, sinh trưởng và sinh methane tối ưu tại pH 7,5 (Hình 3.11B). Ở pH 7 và 8 chủng này thể hiện mức sinh trưởng tương đương nhau, nhưng hoạt tính sinh methane ở pH 7 thấp hơn đáng kể so với pH 8. Ở pH < 7 chủng M37 có mức sinh trưởng cũng như hoạt tính sinh methane thấp.
Mơi trường có nồng độ NaCl từ 17 ÷ 40 g/L là mơi trường thích hợp nhất cho chủng M37 sinh trưởng, quá trình sinh methane giảm đáng kể ở nồng độ NaCl > 40 g/L (Hình 3.11C).
Chủng M37 hầu như không sinh trưởng ở môi trường không bổ sung NaCl. Như vậy có thể kết luận chủng này thuộc nhóm ưa mặn nhẹ, tương tự như các chủng cùng loài M. siciliae là C2J, HI350 và T4/M đã công bố trước đây (Ni, 1994; Elberson và Sowers, 1997).
Trong số ba chủng M. siciliae đã cơng bố (C2J, HI350 và T4/M) thì chỉ có chủng C2J phân lập từ trầm tích biển Canyon có khả năng sử dụng acetate làm cơ chất để sinh trưởng và tạo methane (Elberson và Sowers, 1997). Như vậy về đặc tính sinh học chủng M37 phân lập trong nghiên cứu này gần với chủng C2J hơn so với hai chủng còn lại. Chủng M37 là Methanosarcina được chuyên biệt hóa tạo methane từ acetate và có khả năng sinh trưởng cũng như
tạo methane trong phổ rộng điều kiện nhiệt độ, pH, và đặc biệt mơi trường có hàm lượng muối cao, do vậy có khả năng cạnh tranh tốt trong các bể phân hủy kỵ khí ở điều kiện nước lợ và nước biển.
Trong số các nguồn cơ chất thử nghiệm gồm trimethylamine, methanol, acetate và H2, chủng M37 sinh trưởng tốt nhất với trimethylamine và tiếp theo lần lượt là methanol, acetate và hydro (quan sát trong thời gian nuôi cấy từ 4 đến 6 ngày (Hình 3.12A). Tuy nhiên với cơ chất acetate chủng M37 lại thể hiện khả năng sinh methane vượt trội, đạt mức cao gấp 10 lần so với khi sinh trưởng trên các nguồn cơ chất khác (đo sau 5 ngày ni cấy) (Hình 3.12B).
Hình 3.12. Sinh trưởng và sinh methane ở chủng M37 trên các nguồn cơ chất khác nhau
A – Thay đổi giá trị mật độ quang OD600; B – CH4 sinh ra trong quá trình sinh trưởng Thời gian (ngày) Thời gian (ngày)
M ật đ ộ quan g OD 600 Hàm lư ợng CH 4 (m ol)
Thời gian (ngày)
A
Nhận xét: Mười chủng VSVSMT đã được phân lập từ các mẫu làm giàu với
trầm tích biển Nha Trang và Cát Bà, được xếp vào 2 chi Methanosarcina, Methanolobus và Methanobacterium dựa trên so sánh trình tự 16S rDNA. Bốn chủng đại diện là M21 có độ tương đồng cao nhất với Methanosarcina semeisiae (97%), M23b với Methanolobus profundi (96%), M25a với Methanosarcina vacuolata (96%) và M37 với Methanosarcina siciliae (98%)
có trình tự 16S rDNA gần gũi đã đăng ký tại GenBank. Chủng M37 thể hiện khả năng sinh trưởng trong mơi trường có hàm lượng muối tới 33 g/L, có hoạt tính sinh methane cao và đã được nghiên cứu chi tiết về các đặc điểm hình thái, phân loại và sinh lý quan trọng.