Nghiên cứu các đặc tính sinh học của VSVSMT

Methane Axetat, H2, CO

2.2.2. Nghiên cứu các đặc tính sinh học của VSVSMT

2.2.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái

Tế bào ở pha sinh trưởng của VSVSMT được đưa lên phiến kính phủ thạch 3% và chụp ảnh trên kính hiển vi phản pha ở độ phóng đại 1000. Để quan sát khả năng tự phát sáng của tế bào (nhờ coenzyme F420), tế bào được đưa lên màng nitrocellulose (Millipore) và quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang với kính lọc cho bước sóng trong khoảng 358 ÷ 461 nm (Dolfing và Mulder, 1985).

2.2.2.2. Xác định ảnh hưởng của các điều kiện ni cấy đến sinh trưởng của VSVSMT

Các thí nghiệm được thực hiện trong các bình serum hoặc ống nghiệm có nút cao su chứa mơi trường dịch thể kỵ khí với các điều kiện nhiệt độ, pH, thành phần muối hay cơ chất khác nhau, cụ thể như sau:

Độ muối: Chủng VSVSMT thuần khiết được nuôi trong môi trường dịch thể kỵ khí ở pH 7,2 ÷7,4 có độ muối khác nhau: 1; 5; 10; 17; 20; 26; 33; 40; 50; 60 g/L bằng cách bổ sung dung dịch muối 5 M (NaCl 286,4 g; MgCl26H2O 44,7 g; CaCl22H2O 2,2 g, nước cất dẫn tới 1000 ml) vào các bình hoặc ống nghiệm ni VSVSMT để được nồng độ mong muốn. Sinh trưởng của VSVSMT được đánh giá thơng qua xác định hàm lượng khí methane và mức sinh trưởng (chỉ số OD600 của dịch nuôi) sau thời gian 7 ngày.

Nhiệt độ: Chủng VSVSMT thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch

trimethylamin, methanol (nồng độ 10 mM mỗi loại) ở các nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, 37oC, 45oC. Sinh trưởng của VSVSMT được đánh giá thơng qua xác định hàm lượng khí methane và mức sinh trưởng (chỉ số OD600 của dịch nuôi) sau thời gian 7 ngày.

pH: Chủng VSVSMT thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch thể kỵ

khí có pH khác nhau: 5,0; 5,5; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,5 bằng cách bổ sung các dung dịch Na2CO3 1 M hoặc HCl 1 M, đặt trong tủ ấm 30oC. Sinh trưởng của VSVSMT được đánh giá thơng qua việc xác định lượng khí methane sinh ra và mức sinh trưởng (chỉ số OD600 của dịch nuôi) sau thời gian 7 ngày.

Nguồn cơ chất thích hợp: Chủng VSVSMT thuần khiết được ni cấy trong

mơi trường dịch thể kỵ khí có bổ sung một trong số các chất cho điện tử khác nhau như hydro, acetate, methanol, trimethylamine (10 mM mỗi loại). Nuôi cấy VSVSMT ở điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu, thời gian 7 ngày. Sinh trưởng của VSVSMT được đánh giá thơng qua xác định hàm lượng khí methane sinh ra và mức sinh trưởng (chỉ số OD600 của dịch nuôi).

2.2.3.Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường và chủng thuần khiết

2.2.3.1. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường

DNA tổng số của mẫu làm giàu và các mẫu thí nghiệm trên các mơ hình được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cộng sự (1996) mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách cụ thể gồm có: 100 mM Tris (pH 8); 100 mM EDTA (pH 8); 120 mM đệm phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8); 1,5 M NaCl; 1% CTAB. Các bước tiến hành như sau:

- Trộn 2 ml mẫu với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol 15 ml.

- Phá tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần.

- Bổ sung 40 µl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37oC.

- Thêm 600 µl SDS (20%), ủ ở 65oC trong 2 giờ, 25 phút đảo mẫu một lần. - Bổ sung Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 với lượng tương

đương theo thể tích, sau đó trộn đều. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phịng (20C).

- Thu lấy phần dịch phía trên sang ống sạch, lặp lại bước trên 1 lần.

- Thu lấy phần dịch phía trên sang ống sạch, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, đặt ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ.

- Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ 20oC. Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80% lạnh, ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Loại ethanol, để khơ ở nhiệt độ phịng.

- Hòa tan DNA trong 50 µl nước MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở 20oC.

2.2.3.2. Tách DNA tổng số của chủng thuần khiết

DNA genome của chủng thuần khiết được tinh sạch theo phương pháp của Marmur (1961), gồm các bước như sau:

- Ly tâm 1 ml dịch tế bào ở 5000 ÷ 10000 v/p trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml EDTA (5 mM, pH 8). - Thêm 50 µl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC

trong 1 giờ.

- Thêm 50 µl SDS (20%) và 50 µl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ.

- Thờm 400 àl PCI, trn u trong 1ữ3 phỳt, ly tâm 13 000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. Lặp lại bước này thêm 1 lần.

- Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf sạch. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích 2-propanol (đã để lạnh ở 20oC), trộn đều và giữ ở 20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ. - Ly tâm 13000 vịng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên

để thu kết tủa DNA.

- Rửa DNA trong ethanol 70% (đã để lạnh ở 20oC) trong 1 phút, ly tâm 13000 vịng/ phút, loại ethanol, làm khơ DNA ở nhiệt độ phòng.

- Hịa tan DNA trong 50 µl MQ vơ trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại 20C cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.3.3. Điện di DNA trên gel agarose

Sản phẩm DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100 V trong thời gian 15 phút. Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).