Methane Axetat, H2, CO
2.2.6. Thiết lập và phân tích thư viện gen mcrA (clone library)
Bằng phương pháp PCR và kỹ thuật tách dòng đối với đoạn gen mcrA (kích thước 530 bp) mã hóa cho tiểu phần α của methyl-coenzyme M reductase, sự đa dạng của quần thể VSVSMT có thể được đánh giá một cách khái quát (Luton et al., 2002). Trong nghiên cứu này, Vector pGEM®-T easy (Promega, Mỹ) và Kit pGEM®-T easy vector Systems được sử dụng để tách dòng gen mcrA (Phụ lục 1).
2.2.6.1. Nhân PCR và tinh sạch sản phẩm
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn gen mcrA như sau: 94oC – 5 phút, 94oC – 50 giây, 55oC – 55 giây, 72oC – 1 phút, lặp lại 30 chu kỳ (bước 2 đến 4), 72oC – 10 phút, giữ ở 20oC. Cặp mồi mcrAf (5’-
GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYCCWACAGC-3’) và mcrAr (5’-
TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3’) (Luton et al., 2002) được sử dụng để nhân đoạn gen. Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 2%, 100 V, 400 A trong 20 phút, nhuộm EtBr. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng Kit AccuPrep® (Bioneer, Hàn Quốc).
2.2.6.2. Phản ứng ghép nối gen vào vector
Phản ứng gắn các đoạn DNA nhờ enzyme T4 DNA ligase có thành phần như sau: 1,0 μl sản phẩm DNA tinh sạch (nồng độ 25 ng/μl); 1,0 μl vector đã mở vòng; 1,0 μl T4 DNA ligase; 5 μl buffer T4 ligase (2×) và 3,0 μl H2O. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và đặt ở 4oC trong 18 giờ.
2.2.6.3. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt
Nguyên lý: Dưới tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở giai đoạn sinh trưởng trở nên xốp và giãn ra, tạo điều kiện cho DNA plasmid có thể xâm
Chuẩn bị tế bào khả biến. Tế bào E.coli DH5 được nuôi qua đêm
trong môi trường LB dịch thể (Phụ lục 1) ở nhiệt độ 37oC trên máy lắc 180 vòng/phút. Lần lượt bổ sung 0,5 ml dịch nuôi E.coli sang 30ml môi trường
LB mới sao cho mật độ quang ở 600 nm đạt 0,1 ÷ 0,15 đơn vị. Tiếp tục nuôi cấy các chủng E.coli ở 37oC trên máy lắc đến khi mật độ quang ở 600 nm đạt ~ 0,5 đơn vị. Làm lạnh 25 ml dịch nuôi thu được trong đá, ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 10 phút. Rửa sạch tế bào 2 lần trong điều kiện lạnh bằng dung dịch CaCl2 0,1 M, loại bỏ dịch nổi rồi bổ sung 1,0 ml dung dịch CaCl2 lạnh, 150 μl dung dịch glycerol 75%. Lắc đều dịch tế bào, chia thành các thể tích 200 μl dịch tế bào vào các ống eppendorf sạch, làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng rồi giữ ở – 80oC để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt. Lấy 200 μl tế bào
khả biến ở – 80oC và làm tan dần trên đá trong 5 phút, sau đó bổ sung 10 μl sản phẩm của phản ứng nối vector và DNA, giữ hỗn hợp trên đá 20 phút. Thực hiện phản ứng sốc nhiệt đối với vi khuẩn bằng cách chuyển ống eppendorf sang bể ổn nhiệt 42oC trong 90 giây, sau đó đặt ngay ống eppendorf lên đá trong 2 phút. Bổ sung 900 μl môi trường LB (khơng có ampicillin) vào hỗn hợp, nuôi tĩnh tế bào ở 37oC trong 20 phút và chuyển sang nuôi lắc ở 37oC, tại 200 vòng/phút trong 1 giờ. Ly tâm dịch ni ở 5000 vịng/phút trong 5 phút, loại bỏ một phần dịch trong, hòa tan đều sinh khối rồi lấy 50 μl dịch tế bào cấy trải trên đĩa thạch LB (có bổ sung ampicillin, IPTG, X-Gal như trình bày ở Mục 2, Phụ lục 1), nuôi qua đêm ở 37oC.
2.2.6.4. Tách dịng và giải trình tự gen mcrA
Lựa chọn những khuẩn lạc có màu trắng chuyển sang môi trường LB dịch thể có ampicillin (50 μg/ml) ni lắc trong ống nghiệm ở 37oC, 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Tách plasmid DNA từ các dòng tế bào lựa chọn bằng Kit Gene JET plasmid miniprep Kit – (Fermentas), sau đó nhân đoạn gen mcrA sử dụng
cặp mồi mcrAf và mcrAr ở trên theo chu trình nhiệt như sau: 94oC – 5 phút, 94oC – 50 giây, 55oC – 55 giây, 72oC – 1phút, lặp lại 30 chu kỳ bước 2 đến 4, 72oC – 10 phút, giữ ở 20oC. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose 2%, 100 V, 400 A trong 20 phút, nhuộm EtBr và quan sát dưới tia UV. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng Kit AccuPrep® (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự.
2.2.6.5. Phân tích trình tự gen mcrA và dựng cây phân loại
Trình tự nucleotide của đoạn gen mcrA được xác định trực tiếp hai chiều xuôi và ngược trên máy xác định trình tự. Mức độ tương đồng của các đoạn gen mcrA trong các dòng tế bào được so sánh với các trình tự gen mcrA trên GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sử dụng phần mềm BLAST. Cây phát sinh lồi dựa trên so sánh trình tự gen mcrA được thiết kế dựa trên các
phần mềm Clustal X, Bioedit version, neighbour-joining Tree (Saitou và Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985).