Methane Axetat, H2, CO
NTLR NTMR CBLR CBMR
Hình ảnh điện di cho thấy quá trình làm giàu với rong Ulva sp. cũng đã dẫn đến tích lũy một số nhóm chiếm ưu thế (các vị trí mũi tên chỉ), ở đây đã có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu làm giàu từ Nha Trang và Cát Bà. Tuy nhiên, việc cắt băng và nhân lại đoạn gen để giải trình tự đã khơng thành cơng và không đưa lại thông tin xác định vị trí phân loại cho các băng chính ở thí nghiệm này.
Để có được thơng tin về VSVSMT được làm giàu bằng rong Ulva sp. trong điều kiện môi trường có độ mặn cao, phương pháp tiếp cận khác đã được tiến hành. Cụ thể, gen mcrA mã hóa cho tiểu đơn vị α của methyl-
coenzyme M reductase đã được lựa chọn làm chỉ thị phân tử để xác định VSVSMT trong các mẫu nghiên cứu thơng qua thiết lập và phân tích thư viện gen này sử dụng cặp mồi đặc hiệu mcrAf và mcrAr (Luton et al., 2002) .
3.2.2.2. Đánh giá VSVSMT trong mẫu làm giàu bằng rong biển qua thư viện gen mcrA
Trong bốn mẫu làm giàu từ trầm tích biển Nha Trang, Cát Bà ở điều kiện nước lợ và nước mặn sử dụng rong biển (Hình 3.4) mẫu làm giàu từ trầm tích biển Nha Trang ở điều kiện nước lợ (Hình 3.4; đường điện di số 1, 2) thể hiện khả năng sinh khí ổn định qua các lần làm giàu, lần làm giàu thứ 3 có tổng thể tích khí sinh ra ~ 30 ml (Hình 3.1C). Mẫu làm giàu NTLRE3 do vậy được sử dụng trong nghiên cứu phân tích thư viện gen mcrA.
DNA tổng số tách trực tiếp từ mẫu NTLRE3 được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR nhân đoạn gen mcrA có độ dài ~ 530 bp (Phụ lục 3A) và tách dòng sử dụng vector pGEM®-T và Kit pGEM®-T easy vector System (Promega). Bằng phương pháp sử dụng đĩa thạch có bổ sung IPTG, X-gal và kháng sinh ampicillin để chọn lọc (Phụ lục 3B), 44 dòng khuẩn lạc màu trắng
Trong các nghiên cứu đa dạng thư viện gen mcrA của quần xã
VSVSMT, số lượng các dịng tế bào lựa chọn để phân tích đa dạng khác nhau đáng kể (Stackebrandt et al, 1999), thường gặp nhất là 50 dòng tế bào (Lwin và Matsui, 2014), nhưng cũng có cơng trình thu nhận trên 100 (Zhu et al,
2011; Denman et al, 2007) hay thấp hơn ở mức 38 và 33 dòng tế bào (Shepparda et al, 2005; Bidle et al, 1999). Trong nghiên cứu này, 44 dòng tế bào mang gen mcrA đã được thu nhận cho thư viện gen. Như vậy số dịng tế bào để giải trình tự đủ lớn và phù hợp cho mục đích đánh giá mức độ đa dạng của gen mcrA trong quần xã VSVSMT.
Kết quả so sánh trình tự đoạn gen mcrA thu được từ 44 dòng tế bào đã
lựa chọn trong thư viện gen cho thấy quần xã VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 có tính đa dạng khá cao (Hình 3.5). Tổng số 44 dòng được chia thành 5 nhóm, xếp theo thứ tự từ thấp đến cao theo tỷ lệ giữa số lượng dòng tế bào trong nhóm trên tổng số dịng của thư viện gen (Bảng 3.1).
Hình 3.5. Cấu trúc quần xã VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 dựa trên phân tích thư
viện gen mcrA.
Có thể thấy nhóm V với 24 dịng tế bào trên tổng số 44 là nhóm có tỷ lệ cao nhất (54,5 %). Đây là nhóm gồm những trình tự gen mcrA có độ tương
đồng cao với các đoạn gen mcrA thu được trực tiếp từ môi trường (uncultured
Methanogenium spp. (9,1%) Methanosarcina spp. (9,1%) Methanoplanus spp. (18,2%) Methanosaeta spp. (9,1%) Uncultured archaea (54,5%) (54,5%) (54,5%) (54,5%)
archaea), không phải từ các chủng thuần khiết phân lập được trong phịng thí nghiệm. Nhóm này lại được chia thành hai nhóm phụ, V(1) gồm 15 dịng tế bào, có trình tự gen mcrA nằm trong bộ Methanosarcinales và V(2) gồm 9
dòng tế bào có trình tự gen mcrA nằm trong bộ Methanomicrobiales. Tiếp sau là nhóm IV với 8 dịng tế bào (chiếm tỷ lệ 18,2% trong thư viện gen) có độ tương đồng cao về trình tự gen mcrA với Methanoplanus limicola (96%).
Bảng 3.1. VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 bằng rong Ulva sp.
Tên nhóm Các dịng tế bào trong nhóm Số dịng tế bào Chiếm tỷ lệ (%) Loài gần gũi nhất (% tương đồng về trình tự) Nhóm I 2, 13, 24, 20 4/44 9,1 Methanosarcina acetivorans (98%) Methanosarcina siciliae (98%) Methanosarcina sp., (96%) Methanosarcina mazeii (98%) Nhóm II 25, 35, 34, 37 4/44 9,1 Methanogenium boonei (95%) Methanogenium frigidum (90%)
Nhóm III 14, 23, 41, 43 4/44 9,1 Methanosaeta pelagic (94%)
Nhóm IV 1, 16, 17, 18, 21, 28, 32, 39 8/44 18,2 Methanoplanus limicola (96%) Nhóm V V(1) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 26, 30, 38, 42 15/44 34,1 Uncultured archaea (Methanosarcinales) V(2) 19, 22, 27, 29, 31, 33, 36, 40, 44 9/44 20,4 Uncultured archaea (Methanomicrobiales)
Ba nhóm cịn lại I, II, III cùng có 4 dịng tế bào (mỗi nhóm chiếm 9,1% trong thư viện gen) nhưng có vị trí phân loại gen mcrA khác nhau. Nhóm III gồm các trình tự gen mcrA thuộc chi Methanosaeta, gần gũi nhất là M. pelagic (94% tương đồng). Nhóm II gồm các trình tự gen mcrA thuộc chi Methanogenium, nhưng có 2 lồi khác nhau xuất hiện với độ tương đồng
tương ứng là M. boonei (95%) và M. frigidum (90%). Nhóm I gồm các trình
tự gen mcrA thuộc chi Methanosarcina nhưng rất đa dạng ở mức độ lồi, có 4 lồi khác nhau xuất hiện với độ tương đồng cao, gồm Methanosarcina acetivorans (98%), Methanosarcina siciliae (98%), Methanosarcina sp.
(96%) và Methanosarcina mazeii (98%). Kết quả so sánh trình tự gen mcrA từ 44 dòng tế bào trong thư viện gen với trình tự từ các lồi VSVSMT đã công bố được thể hiện trên cây phát sinh chủng loại tại hình 3.6.
C31C40 C40 C32 C28 C21 C39 C1 C16 C17 C18Methanoplanus limicola (FR745248.1)C44 C30 C29 C36 Methanogenium boonei (DQ229161.1) Methanogenium frigidum(DQ229158.1) C35C34 C37 C25 C33 C19 C22 C27 C2 Methanosarcina siciliae (KC951109) C13 C20 C24 C43 C23 C41 C14
Methanosaeta pelagic (AB679169.1)Uncultured archaeon Mycobacterium alsiensis 0.05 C15 C10 C11 C12C42 C38 C09 C07 C26 C04 C05C03 C08 C06 Nhóm V(1) Nhóm III Nhóm I Nhóm V(2) Nhóm IV Methanosarcinales Methanomicrobiales 1000 975 1000 1000 1000 997 862 998 1000 832
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gen mcrA của 44 dòng tế bào lựa chọn so
sánh với các loài VSVSMT gần gũi. Đơn vị = 0,05 Knuc trong trình tự nucleotide. Mycobacterium
Như vậy VSVSMT được xác định trong thư viện gen mcrA thiết lập tại
nghiên cứu này nằm trong hai bộ Methanomicrobiales (nhóm II, IV và V(2))
và Methanosarcinales (nhóm I, III và V(1)). Nghiên cứu của Ellis và cộng sự (2012) về đa dạng VSVSMT trong bể phân hủy kỵ khí sử dụng cơ chất rong biển thơng qua phân tích trình tự gen mcrA bằng phương pháp
pyrosequencing cũng đã cho thấy Methanosarcinales (trong đó chủ yếu là chi
Methanosaeta) chiếm tới 74% trong số 454 trình tự mcrA đã phân tích. Bên
cạnh đó, Methanobacteriales và Methanomicrobiales là những nhóm đồng
hành với tỷ lệ tương ứng là 17 và 9%. Trong nghiên cứu khác về VSVSMT ở trầm tích biển, Mori và cộng sự (2012) đã cơng bố tìm thấy Methanosaeta
spp. chiếm 3,9 – 11,8% trong tổng số các trình tự 16S rDNA của cổ khuẩn thông qua phương pháp RT- PCR.
Về đặc điểm sinh học, VSVSMT thuộc bộ Methanomicrobiales (như các chi Methanogenium, Methanoplanus, Methanomicrobium...) chuyên biệt sử
dụng H2 + CO2 và formate làm chất cho điện tử để tạo thành CH4, một số lồi có thể sử dụng alcohol, tuy nhiên VSVSMT thuộc bộ Methanomicrobiales
hồn tồn khơng sử dụng acetate (Whitman et al, 2006). Trong khi đó, VSVSMT thuộc bộ Methanosarcinales (như các chi Methanosarcina, Methanolobus, Methanosaeta,...) lại có tính chuyên biệt cao trong sử dụng
acetate và một số hợp chất cacbon bậc 1 như methanol, methylamine để tạo thành CH4 (Whitman et al, 2006; Madigan et al, 2012).
Trong q trình phân hủy kỵ khí sinh methane thì các lồi VSVSMT sử dụng H2 chiếm ưu thế trong giai đoạn đầu khi acetate còn chưa được sinh ra, tuy nhiên sau đó ưu thế lại thuộc về các lồi sử dụng acetate và methane tạo ra từ acetate chiếm tới 70% tổng lượng methane sinh ra trong toàn bộ quá trình (Lettinga, 1995; Bitton, 1999; Whitman et al, 2006).
Có thể nhận thấy rằng với thành phần VSVSMT trong mẫu trầm tích biển Nha Trang sử dụng cơ chất là rong biển Ulva sp. (NTLRE3) đa dạng hơn so với mẫu trầm tích sử dụng cơ chất là methanol hoặc acetate vì gồm cả các lồi sử dụng hydro và các lồi sử dụng acetate. Trong khi đó mẫu trầm tích sử dụng methanol và acetate chỉ gồm các loài thuộc chi Methanolobus sp. và
Methansarcina sp.. Vì vậy mẫu làm giàu NTLRE3 tại nghiên cứu này là nguồn VSVSMT có khả năng sử dụng các chất hữu cơ đa dạng và có thể thực hiện q trình phân hủy kỵ khí sinh methane đối với các nguồn ô nhiễm hữu cơ trong tự nhiên, cho nên mẫu làm giàu NTLRE3 được sử dụng làm nguồn VSVSMT cho nghiên cứu thử nghiệm khả năng phân hủy chất thải hữu cơ.
Nhận xét: Mẫu làm giàu với cơ chất methanol hoặc acetate có VSVSMT thuộc các chi Methanosarcina và Methanolobus chiếm ưu thế thông qua phân tích PCR-DGGE 16S rDNA. Trong mẫu làm giàu bằng rong Ulva sp. với
trầm tích biển Nha Trang NTLRE3 một số nhóm chính Methanolobus spp., Methanosarcina spp., Methanogenum spp., Methanosaeta spp. cùng với số
lượng lớn các loài chưa phân lập được đã được xác định thông qua phương pháp thiết lập và phân tích thư viện gen mcrA.