Phương pháp PCR-DGGE

Methane Axetat, H2, CO

2.2.4. Phương pháp PCR-DGGE

2.2.4.1. Khuếch đại đoạn 16S rDNA cho phân tích DGGE (350 bp)

Đoạn 16S rDNA với độ dài 350 bp được khuếch đại trong phản ứng

PCR sử dụng cặp mồi 0348aF (5’-TCCAGGCCCTACGGG-3’) và 0691R (5’-

GGATTACARGATTTCAC-3’) (Watanabe et al., 2004). Để tạo tính ổn định việc phân tách của các sản phẩm PCR trên gel điện di biến tính, kẹp GC (CGC CCG CCG CGC GCG GGG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) (Muyzer et al., 1993) được gắn vào đầu 5’ của đoạn mồi 0348aF. Phản ứng PCR (Bảng 2.1) được thực hiện với chế độ nhiệt: 94°C – 3 phút; 40 chu kỳ của 94°C – 1 phút, 49°C – 1 phút và 72°C – 2 phút; 72°C – 8 phút. Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE, ở 110 V, 15 phút.

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE

Thành phần phản ứng tích (µl) Thể Chu kỳ nhiệt của PCR

H2O MQ 25 94°C trong 3 phút 94°C trong 1 phút 49°C trong 1 phút 72°C trong 2 phút 40 chu kỳ 72°C trong 8 phút 20C dừng phản ứng 10 × Taq buffer 5 BSA (3 mg/ml) 5 MgCl2 (20 mM) 5 dNTP (2,5 mM mỗi loại) 5 Mồi 0348aF-GC (50 pmol/µl) 1 Mồi 0691R (50 pmol/µl) 1 DNA khn 2

Taq polymerase (5 u/µl) 1 Tổng thể tích phản ứng 50

2.2.4.2. Điện di biến tính DGGE

Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 8% với dải biến tính urea/formamid từ 25% đến 60%. Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm 1 TAE, ở nhiệt độ 60C, tại 200 V, trong 3,5 giờ. Sau khi điện di, gel polyacrylamide được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad, Mỹ).

2.2.4.3. Cắt băng và thôi gel

Băng điện di được cắt và thôi trong nước MQ đã khử trùng qua đêm tại 4C. Dịch thôi DNA được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR như chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE (bảng 2.1) với cặp mồi 0348aF (khơng có kẹp GC) và 0691R. Sản phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch bằng Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự sử dụng mồi 0348aF.