Làm giàu và phân lập VSVSMT

Methane Axetat, H2, CO

2.2.1. Làm giàu và phân lập VSVSMT

2.2.1.1. Làm giàu VSVSMT

VSVSMT trong các mẫu trầm tích biển đã thu thập được làm giàu bằng cách cấy vào bình serum chứa mơi trường khống dịch thể kỵ khí nước mặn (26,4 g NaCl/L mơi trường) hoặc nước lợ (13,7 g NaCl/L môi trường) (thành phần môi trường chi tiết ở Phụ lục 1, mục 1) với tỷ lệ 10% w/v, nuôi tĩnh trong tủ ấm 30oC. Nguồn cơ chất cho VSVSMT trong thí nghiệm làm giàu là một trong số các hợp chất methanol, Na-acetate, trimethylamine (10 mM)

sau 5 ÷ 7 ngày ni trong đó 10% thể tích dịch ni được chuyển sang mơi trường mới. Số lượng VSVSMT cũng như khả năng tạo khí trong các mẫu được xác định để làm cơ sở đánh giá cho quá trình làm giàu.

2.2.1.2. Phân lập VSVSMT

Mẫu làm giàu sau lần cấy truyền thứ 3 được dùng để phân lập VSVSMT. Việc phân lập được tiến hành theo phương pháp dãy pha loãng trên các ống thạch bán lỏng (1%) với môi trường khống có thành phần tương tự môi trường dùng trong bước làm giàu (Rabus et al., 2006) (Hình 2.2).

Hình 2.2. Các bước phân lập VSVSMT thuần khiết bằng phương pháp ống thạch bán lỏng

(1) – Bình làm giàu VSVSMT ở lần cấy truyền thứ 3; (2) – Cấy dịch ni (sau khi pha lỗng ở các mức khác nhau) vào ống nghiệm chứa mơi trường khống thạch bán lỏng (1%) và hỗn hợp cơ chất, để đơng và đuổi oxy bằng sục khí N2; (3) – Đặt ống thạch ở tư thế đảo đầu, nuôi tại 30C trong thời gian 5 – 7 ngày; (4) – Tách khuẩn lạc đơn bằng mao quản thủy tinh chế từ pipet Pasteur; (5) – Ống nghiệm có nắp cao su chứa mơi trường dịch thể kỵ khí.

Các ống thạch bán lỏng (9 ml môi trường khoáng chứa 1% thạch) sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (1 ml) từ dãy pha loãng sử dụng mẫu làm giàu được để đơng, đuổi oxy bằng khí N2/CO2 (90:10, v:v) và nuôi ở tư thế đảo ngược tại 30oC trong bóng tối. Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống thạch được tách bằng mao quản thủy tinh chế từ pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể kỵ khí. Hỗn hợp Na-Acetate, methanol và trimethylamin (10

mM mỗi loại) được bổ sung làm cơ chất trong môi trường thạch và môi trường dịch thể phân lập. Q trình tinh sạch trên mơi trường thạch bán lỏng được lặp lại với mỗi chủng phân lập từ 2÷3 lần.