- Chỉ tiêu theo dõi:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THAỎ LUẬN
3.5.3. Kết quả chọn lọc cây cà chua chuyển gen bằng lai Southern
3.5.3.1. Kết quả cắt DNA tổng số bằng enzyme cắt giới hạn
Do phản ứng PCR có ựộ nhạy cao nên vẫn có thể còn có những kết quả dương tắnh giả. Lai Southern vừa có ý nghĩa khẳng ựịnh chắc chắn cây chuyển gen, loại bỏ kết quả dương tắnh giả của PCR, ựồng thời lai Southern còn có khả năng giúp ta xác ựịnh ựược trong quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật có thế có một ựoạn T- DNA hoặc nhiều ựoạn T- DNA xâm nhập vào tế bào chủ cũng như xác ựịnh ựược ựộ nguyên vẹn của T- DNA ựược chèn vào vật chủ. để tiến hành lai Southern DNA tổng số ựược cắt bằng enzyme giới hạn XbaỊ
Trước tiên, các mẫu DNA tổng số ựã kiểm tra ựộ tinh sạch ựược sử lý bằng enzyme giới hạn XbaỊ Kết quả ựiện di sản phẩm cắt giới hạn của một số dòng cà chua ựược thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5: Hình ảnh ựiện di kiểm tra sản phẩm enzyme cắt giới hạn
Ghi chú: đường chạy 1 ựến 15 là sản phẩm cắt giới hạn các mẫu DNA
Kết quả ựiện di dựa trên Hình 3.5 cho thấy các DNA của các dòng cà chua ựã ựược cắt thành các ựoạn DNA nhỏ. điều ựó chứng tỏ sản phẩm cắt giới hạn có thể ựược sử dụng ựể tiến hành phản ứng lai Southern.
3.5.3.2. Chọn lọc cây cà chua chuyển gen bằng Southern blot
để xác ựịnh những phiên bản của promoter 35S chứa trong bộ gen của cây cà chuạ Các mẫu DNA ựược phân lập từ cây cà chua ựược sử dụng phân tắch Southern. Kết quả ựược hiển thị ở Hình 3.6 và bảng 4.14 dưới ựây:
Hình 3.6: Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một số dòng cà chua chuyển gen
Ghi chú: đường chạy từ số 1 ựến 14 là ựường chạy của cây số 1 ựến cây số 14 tương ứng trong Bảng 3.15. đường chạy M là ựường chạy của macker IIỊ
Hình 3.7: Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một số dòng cà chua chuyển gen
Ghi chú: đường chạy từ số 15 ựến 28 là ựường chạy của cây số 15 ựến cây số 28
tương ứng trong Bảng 3.14. đường chạy M là ựường chạy của macker IIỊ
M (-) 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bảng 3.13: Kết quả lai Southern với mẫu dò 35S
STT Kắ hiệu cấu trúc Số calus Số bắng phản ứng với mẫu
dò 35S 1 IR-6-2 37 2 2 IR-6-2 41 3 3 IR-6-2 42 3 4 IR-6-2 43 2 5 IR-6-2 50 3 6 IR-6-2 51 3 7 IR-6-2 55 3 8 IR-6-2 56 4 9 IR-6-2 57 3 10 IR-6-2 58 0 11 IR-6-2 71 2 12 IR-6-2 72-2 1 13 IR-6-2 77 0 14 IR-6-2 78 0 15 IR-6-2 107 3 16 IR-6-2 108 2 17 IR-6-2 121 1 18 IR-6-2 122 1 19 IR-6-2 123 2 20 IR-6-2 124 2 21 IR-6-2 126 1 22 IR-6-2 127 3 23 IR-6-2 44 1 24 IR-6-2 73 1 25 IR-6-2 55-1 1 26 IR-6-2 65 1 27 IR-6-2 73 1 28 IR-6-2 79 0
Kết quả tổng hợp trong Bảng 3.13 cho thấy có 4/28 mẫu không có promoter chèn vào hệ gen chiếm 14,28 %, có 9/28 mẫu cà chua có một promoter chèn vào hệ gen chiếm 32,14%, 6/28 mẫu cà chua có hai promoter chèn vào hệ gen chiếm 21,42%,8/28 mẫu cà chua có ba promoter chèn vào hệ gen chiếm 28,57% và 1/28 mẫu cà chua có ba promoter chèn vào hệ gen chiếm 3,57%.
Liên kết với kết quả PCR ở Bảng 3.12 và 3.13 cho thấy có sự khác nhau về kết quả PCR và kết quả lai Southern. điều này có thể do trong các cây chuyển gen có chứa vi khuẩn Agrobacterium còn mang plasmid vector chứa T-DNẠ Khi tách chiết DNA tổng số của cây, DNA-plasmid cũng ựược tách chiết. Với ựộ nhạy cao của phản ứng PCR thì chỉ cần một vài phân tử plasmid-DNA khuôn, sản phẩm PCR vẫn ựược hình thành tạo nên băng DNA trên hình ảnh ựiện di (kết quả dương tắnh). Tuy nhiên ựộ nhạy của kỹ thuật Southern blot thấp hơn, ựiều này dẫn ựến sản phẩm lai không ựược hình thành. Kết quả này cho thấy lai Southern là kỹ thuật vô cùng cần thiết ựể khẳng ựịnh chắc chắn các cây chuyển gen, tránh ựược sai sót không ựáng có cho các bước phân tắch, ựánh giá cây chuyển gen sau nàỵ