- Chỉ tiêu theo dõi:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THAỎ LUẬN
3.4.6. Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống cà chua DM
để tăng hiệu quả chuyển gen vào trong cây thì việc tạo dựng quy trình chuyển gen có hiệu quả là nhân tố then chốt ựể tạo ra những giống cây trồng mang gen mong muốn. Do ựó, chúng tôi ựã thắ nghiệm sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 chứa vector pGreen0229/pSoup mang gen IR62 ựể chuyển vào giống cà chua DM166. Từ những kết quả nghiên cứu về sự tái sinh của cây và tối ưu các yếu tố ảnh hưởng ựến quá trình chuyển gen của cà chua DM166, chúng tôi có ựược quy trình chuyển gen như sau:
- Lá mầm 10 ngày tuổi ựược cắt nhỏ với kắch thước 5x5 mm ngâm vào trong dung dịch BCM có bổ sung 8 ộM Zea/5 ộM IAA sau ựó ựổ bỏ dung dịch ựó ựi và ựể qua ựêm khoảng 20 giờ trước khi ựem lây nhiễm.
- Các mẫu cắt này ựược nhiễm với dung dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium (OD 600=0.5) 80 phút trong môi trường BCM lỏng có pH 5,5, bổ sung 8 ộM Zea/5 ộM IAA và 100 ộM/l Acetosyringone, ựược ựặt trong ựiều kiện nhiệt ựộ 260C.
- Sau ựó, các mảnh lá mầm ựược thấm khô và chuyển sang môi trường ựồng nuôi cấy: môi trường BCM thạch, pH 5,5, bổ sung 8 ộM Zea/5 ộM IAA, nuôi trong ựiều kiện tối ở 260C trong 3 ngàỵ
- Tiếp theo mẫu ựược chuyển sang môi trường diệt khuẩn: môi trường thạch BCM có pH 5.8, bổ sung 8 ộM Zea/8 ộM IAA và 50 mg/l kanamycin nuôi trong ựiều kiện nhiệt ựộ 26oC, với chế ựộ chiếu sáng 16 giờ sáng/8giờ tốị
- Sau 10 ngày, các mẫu ựược chuyển sang môi trường chọn lọc có 50 mg/l kanamycin và 1.5 ppm chất chọn lọc glufosinate, nhiệt ựộ 26oC. Cấy chuyền sau 14 ngày ựể tránh hiện tượng tái nhiễm, 2 lần cấy chuyền.
- Sau một tháng, các callus ựược ựưa vào môi trường có chất chọn lọc thắch hợp ựể tái sinh chồi: môi trường BCM thạch, bổ sung 8 ộM Zea/5 ộM IAA, 50 mg/l kanamycin và 1.5 ppm glufosinate, việc tái sinh chồi ựược thực hiện ở 26oC. Tiến hành 3 lần cấy chuyền, sau ựó chuyển vào môi trường mới có 8ộM Zea/3ộM IAA (2 lần cấy chuyền) và môi trường mới có 6 ộM Zea/1ộM IAA
- Khi chồi ựược khoảng 2-3cm (thời gian khoảng 7 tuần) thì chuyển sang môi trường tạo rễ kéo dài thành cây hoàn chỉnh (khoảng 3 tuần): chồi ựược cấy trong môi trường BCM có 2ộM IAA, 50 mg/l kanamycin và 1.5 ppm chất chọn lọc (1 lần cấy chuyển) sau ựó chuyển sang môi trường mới có 3.0ppm chất chọn lọc (1 lần cấy chuyển).