2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị thắ nghiệm
- Giống cà chua DM166 ựược cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học Ờ Viện Nghiên cứu Rau Quả.
- Vi khuẩn: Agrobacterium EHA 105 ựược lưu giữ tại Viện Nghiên cứu Rau Quả - Hệ thống plasmide vector: pGreen0229/pSoup ựược lưu giữ tại Viện Nghiên cứu Rau Quả.
- Môi trường nuôi cấy mô: MSB5 + 30 g ựường, 500mg MES, các chất ựiều tiết sinh trưởng (đTST) bổ sung tùy theo từng thắ nghiệm.
- Môi trường lây nhiễm và ựồng nuôi cấy: MSB5 + 30 g ựường, 500mg MES + đTST + Acetosyringone theo yêu cầu từng thắ nghiệm.
- Môi trường nuôi cấy khuẩn: YEP (1 lit: 10g Tryptone, 5g Yeast extract, 10g NaCl)
- Hóa chất thắ nghiệm: PCR master mix, taq DNA polymeraze của hãng Fermentas, mồi ựặc hiệu cho promoter 35S và trình tự mục tiêu kháng xoăn vàng lá từ hãng IDT, các loại dung dịch ựệm cho lai Southern ( NaCl, NaOH, axit malic, HCl, hybridizationẦẦ) từ hãng Roche và Sigma, Enzyme cắt giới hạn XbaI của hãng
Fermentas sản xuất.
- Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR khuếch ựại vùng gen mục tiêu nghiên cứu ựược trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Mục tiêu
khuếch ựại Tên mồi Trình tự nucleotide (5Ỗ→3Ỗ)
Tm (oC)
Mồi xuôi TGGATTGATGTGATAACATGGTG 64 Promoter
35S Mồi ngược AGGAAGGGTCTTGCGAAGG 58
Mồi xuôi TATGCGTCGTTGGCAGATTGG 64
Gen kháng
TYLCV(IR) Mồi ngược ATCCTCTAGAAATCGCGGCCATCC 74
- Thiết bị thắ nghiệm chắnh:
Bộ ựiện di agarose Power Pac 300 do hãng BioRad sản xuất. Lò lai phân tử HL-2000 Hibrilinker-UPV do Mỹ sản xuất. Lò lai phân tử Problot 12S do Labnet, Mỹ sản xuất.
Máy ựo nồng ựộ DNA SmartSpecTM Plus do hãng Bio Rad sản xuất Bể ổn nhiệt Memmert do đức sản xuất.
Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417R do hãng Eppendorf, đức sản xuất. Máy ly tâm Spectrafuge do Labnet, Mỹ sản xuất.
Máy lắc nghiền mô lá MM 301 do hãng Retsch, đức sản xuất. Bộ micropipet do hãng Eppendorf, đức sản xuất.
Tủ lạnh -20oC do hãng Sanaky sản xuất.
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Xác ựịnh hệ thống tái sinh cho các loại mô phục vụ cho chuyển gen (giống DM166) và ựánh giá sự ổn ựịnh ựộ bội của thể tái sinh
Hệ thống tái sinh của 3 loại mô: Thân mầm, lá mầm, lá trưởng thành.
- Phương pháp xử lý mẫu: Hạt cà chua ựược khử trùng bằng H2O2 nồng ựộ20% trong 6 phút và ựược rửa lại 5 lần với nước cất vô trùng, ủ hạt trong ựiều kiện tối ở 26- 300C cho tới khi nảy mầm thì tiến hành reo vào ựĩa petri với môi trường thạch MSB5. Tiếp tục ựặt ựĩa hạt trong ựiều kiện tối khoảng 16 giờ, khi hạt bắt ựầu xuất hiện thân mầm thì ựưa ra ựiều kiện phòng nuôi có quang chu kỳ 16h chiếu sáng/8h tốị
- Nền môi trường cơ bản: MSB5 + 30 g ựường + 500mg/l MES
- Cách thức tiến hành: Theo dõi sự nảy mầm của hạt, khi hạt phát triển thành cây có ựủ lá mầm và lá thật thì tiến hành làm các thắ nghiệm.
+ đối với thân mầm: cắt bỏ phần gốc và rễ, phần còn lại ựược cắt thành từng ựoạn dài khoảng 0,5 cm. Cấy 20 ựốt thân trên một ựĩa petri, mỗi công thức ựược nhắc lại 3 lần với 40 mẫu /lần nhắc.
+ đối với lá mầm và lá trưởng thành ựược cắt bỏ hai ựầu, cắt phần còn lại thành từng ựoạn có chiều dài 0,5cm. Cấy 15 lá trên một ựĩa petri, mỗi công thức ựược nhắc lại 3 lần với 30 mẫu lá/lần nhắc.
Các thắ nghiệm ựược bố trắtheo kiểu ngẫu nhiên hoàn tòan trong ựiều kiện 16 giờ sáng/ 8 giờ tối, 260C ổ 1. Việc cấy chuyển ựược tiến hành ựịnh kỳ 2 tuần/lần.