- Chỉ tiêu theo dõi:
2.3.1. Phát hiện cây chuyển gen bằng PCR
- Kiểm tra sự có mặt của promotor 35S bằng phản ứng PCR ựặc hiệụ - Kiểm tra sự có mặt của trình tự mục tiêu bằng phản ứng PCR ựặc hiệụ
2.3.1.1.Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Các mẫu cà chua ựược tách chiết DNA tổng số dựa trên phương pháp của Evenyl Klocke và cộng sự (1994) [31]. Cụ thể quy trình như sau:
Bước 1: Cho 400ộl solution I (0,2M Tris-HCl+ 0,25M EDTA+ 0,5% SDS) vào ống eppendoff có chứa mẫu lá, sau ựó cho thêm một viên bi sắt vàọ
Bước 2: Nghiền mẫu bằng máy lắc 25 vòng trên giâỵ
Bước 3: Ủ ở 65oC trong vòng 15 phút, cứ 5 phút thì ựảo nhẹ một lần.
Bước 4: Thêm 200ộl K-acetat vào ống mẫu, ựảo ựều, tiếp tục ủ trong ựá vảy hoặc tủ lạnh sâu 30 phút.
Bước 5: Ly tâm 12000/ phút, hút dịch lỏng chuyển sang ống eppendoff mớị
Bước 6: Bổ sung isopropanol vào và ựảo nhẹ, sau ựó ủ vào ựá vảy hoặc tủ âm sâu 20 phút.
Bước 7: Ly tâm 12000/ phút trong 15 phút. Bước 8: Loại dịch thu cặn.
Bước 9: Rửa bằng cồn 70%.
Bước 10: để khô trong ựiều kiện bình thường. Bước 11: Hòa tan bằng nước.
2.3.1.2. Phương pháp khuếch ựại trình tự promotor 35S và vùng gen kháng xoăn lá cà chua bằng phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệụ
Vùng promoter 35S và vùng trình tự gen kháng vi rút xoăn vàng lá ở cà chua ựược khuếch ựại bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi ựặc hiệụ Thành phẩn phản ứng PCR như sau:
10x Dream taq green buffer: 1,5 ộl
dNTPs (2,0 mM): 0,5 ộl
Muồi xuôi (10 ộM): 0,5 ộl
Muồi ngược (10 ộM): 0,5 ộl
Dream Taq DNA polymerase (5U/ộl): 0,1 ộl
H2O: 12 ộl
điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuyếch ựại vùng promoter như sau: Giai ựoạn biến tắnh ban ựầu ở 94oC trong 4 phút, 30 chu kỳ khuếch ựại gồm các bước biến tắnh ở 94oC trong 1 phút, gắn mồi ở 58oC trong 30 giây, kéo dài mồi ở 72oC trong 1 phút và giai ựoạn kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 7 phút sau ựó ủ ở 4oC cho ựến khi lấy sản phẩm.
đối với phản ứng PCR khuếch ựại vựng trình tự mục tiêu kháng vi rút vàng xoăn lá cà chua, phản ứng PCR ựược thực hiện với nhiệt ựộ gắn mồi là 62oC.
2.3.1.3. Phương pháp ựiện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
Bước 1: Chuẩn bị bản gel: cân 1,6g agarose pha trong 200ml TAE 0,5X. Hòa tan hoàn toàn agarose trong TAE bằng ựun sôi trong lò vi sóng. để nguội ựến khoảng 60oC, tiến hành ựổ bản gel rồi ựể bản gel agarose ựông hoàn toàn.
Bước 2: Chạy ựiện di:
Tra mẫu: Tra hết sản phẩm PCR vào giếng. Chạy ựiện di ở hiệu ựiện thế 120V trong khoảng 30 phút.
Nhuộm bản gel với dung dịch edthidium bromide trong 30 phút. Hiển thị kết quả ựiện di dưới tia UV, ghi lại hình ảnh ựiện di Phân tắch kết quả ựiện di