1.9.1.1. Polymerase Chanin reaction (PCR)
Kỹ thật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp Ờ Polymerase Chanin reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các ựoạn DNA với tốc ựộ nhanh, chắnh xác cao ựược thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR).
Phương pháp này ựược tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất ựược enzyme DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus và một số vi khuẩn ưa nhiệt khác.Kỹ thuật PCR ựược coi là phương pháp nền quan trọng có nhiều ứng dụng trong công nghệ di truyền. Muốn tiến hành phản ứng PCR, cần phải có các thành phần sau [46]:
Axit deoxyribonucleic khuôn (DNA template): Có thể là DNA mạch kép hay mạch ựơn hoặc RNA ựược tách chiết từ các ựối tượng nghiên cứụ DNA phải có ựộ nguyên vẹn caọ
Mồi (primer): Mồi là những ựoạn DNA sợi ựơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNẠ Chúng nhận ra phần DNA ựược nhân lên, bắt cặp bổ sung với một ựầu của DNA mẫu và tạo ra vị trắ bắt ựầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).
Enzyme DNA polymerase: đây là enzyme xúc tác quá trình lắp ráp các nucleotit A, T, G, C vào mạch DNA mới ựang tổng hợp.
Các loại nucleotid
Trong các phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường ựược sử dụng ở dạng dẽoynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng ựộ cân bằng trong một phản ứng (200ộM/loại nucleotid).
Nước: Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme giới hạnẦNói cách khác là không chứa bất kỳ một thành phần nào khác.
Dung dịch ựệm 10x (100mM KCl, 100mM (NH4)2 SO4, 200mM Tris-HCl pH
8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100
Ion Mg2+: Nồng ựộ ion Mg2+ cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh ựến phản ứng PCR và nó tùy thuộc vào từng phản ứng. Nồng ựộ ion Mg2+ tối ưu là 150-200ộM. Người ta thấy rằng nếu nồng ựộ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi hơn.
Ba giai ựoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR gồm [51]
- Giai ựoạn biến tắnh (denaturation)
Trong giai ựoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tắnh ở nhiệt ựộ cao (thường là 94oC ựến 95oC) trong vòng 30 giây ựến một phút, tất cả các liên kết hidro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi ựơn.
- Giai ựoạn lai (hybridization)
Nhiệt ựộ ựược hạ thấp từ từ ( thường từ 40-70oC, thấp hơn nhiệt ựộ nóng chảy của mồi ựược sử dụng khoảng từ 3-5oC), cho phép các mồi bám vào phân tử DNA sợ ựơn, ựánh dấu phần DNA cần ựược khuếch ựạị Giai ựoạn này kéo dài từ 30s ựến một phút (còn ựược gọi là giai ựoạn ủ).
Nếu nhệt ựộ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt ựộ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả.
Công thức ựể xác ựịnh nhiệt ựộ nóng chảy tương ựối là Tm=4(G+C)+2(A+T). - Giai ựoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt ựộ ựược tăng ựến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi ựơn và dùng nó làm khuôn tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bằng cách kéo dài các phần ựã ựược ựánh dấu bởi các mồị Thời gian của giai ựoạn này phụ thuộc vào kắch thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây ựến nhiều phút. Ở giai ựoạn này của chu kỳ cuối cùng thời gian ựược tăng thêm vài phút ựể các sợi DNA chưa sao chép xong hoàn thành quá trình tổng hợp.
Sau mỗi chu kỳ số bản sao của DNA mẫu lại ựược tăng lên gấp ựôị đây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ một phân tử DNA mẫu sau n chu kỳ sẽ tạo ra 2n bản sao phân tử DNẠ
Kỹ thuật PCR ngày càng ứng dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và kỹ thuật gen: phân dòng gen, tách dòng gen, lập bản ựồ gen, chẩn ựoán bệnh truyền nhiễmẦvà sử dụng trong kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo giống vật nuôi và cây trồng mới (Khuất hữu Thanh ,2006) [17].
1.9.1.2. Southern blot hybridization
Southern blot hybridization là một trong những phương pháp trung tâm của sinh học phân tử. Nó còn có tên gọi khác là Southern hybridization, phương pháp lai southern hay phương pháp lai DNẠ Phương pháp lai DNA cho phép xác ựịnh sự có mặt của những trình tự nucleotit trên một ựoạn DNA nào ựó có trong một hỗn hợp các ựoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò (DNA mẫu dò) ựã ựược ựánh dấu bằng Dig với ựoạn DNA có chứa trình tự bổ sung với mẫu ựó các bước chắnh của kỹ thuật này gồm (Angerer LM.và cs, 1987)[24]:
- Chiết tách DNA nghiên cứu, sau ựó cắt DNA bằng enzyme giới hạn. - Tiến hành ựiện di hỗn hợp sản phẩm cắt trên gel agarosẹ
- Làm biến tắnh (tạo thành các sợi ựơn) các băng DNA trên gel ựiện dị
tắnh trên gel lên một tấm lọc gọi là màng laị Trong quá trình chuyển, vị trắ các ựoạn DNA vẫn ựược giữ nguyên không thay ựổị
- Các ựoạn DNA cố ựịnh trên màng lai ựược ựem lai với dung dịch mẫu dò (DNA probe) ựã ựước ựánh dấu hoặc bằng Dig hoặc bằng một chất gây phản ứng màu theo nguyên tắc bổ sung.
- Sau khi kết thúc phản ứng lai, màng lai ựược rửa loại các mẫu dò không tham gia phản ứng laị
- Phát hiện vị trắ lai nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghị Nơi xảy ra phản ứng lai sẽ mang hoạt tắnh phóng xạ ( do có mặt mẫu dò), khi ựặt phim lên tấm lọc nơi có phản ứng lai sẽ phát xạ vào phim. Tráng phim sẽ thu ựược các vết ựen tại nơi phát xạ ựó chắnh là ựịa ựiểm laị
Phương pháp lai Southern ựược thiết kế ựể xác ựịnh sự hiện diện, kắch thước, số lượng bản sao, tắnh ựồng dạng của DNA trong một phức hợp. Tuy nhiên nó cũng có nhiều hạn chế như mất nhiều thời gian, nhiều công ựoạn phức tạp. Ngoài ra lai Southern cần lượng DNA từ mẫu cao, chất lượng DNA tốt và còn phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật tạo dòng ựể tạo probe (Angerer LM.và cs, 1987)[24].