- Chỉ tiêu theo dõi:
2.3.2. Chọn lọc cây chuyển gen ựộc lập bằng kỹ thuật Southern
- Cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn.
- Chọn lọc cây cà chua chuyển gen bằng lai Southern
2.3.2.1.Phương pháp cắt DNA tổng số bằng enzyme cắt giới hạn
DNA tổng số của các dòng cà chua ựược cắt bằng enzyme XbaI (Fermentas-
đức). Thành phần phản ứng ựược thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng cụ thể như sau:
+ Nước khử ion: 239ộl nước + 10xbuffer: 30ộl
+ DNA: 30-40ộg + Enzyme: 3ộl
Sau khi kết thúc phản ứng, bổ sung 6 ộl RNase vào hỗn hợp sản phẩm cắt giới hạn, ựảo trộn nhẹ bằng micropippet, ly tâm nhẹ. Sau ựó tiến hành tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn theo quy trình như sau:
Bước 1: Ủ ở 37oC trong 30 phút.
Bước 5: Ủ ở 70oC trong 10 phút ở bể ổn nhiệt, sau ựó ựặt vào ựá lạnh ngaỵ
Bước 6: Bổ sung NaCl 5M theo tỉ lệ hỗn hợp sản phẩm cắt giới hạn/5M NaCl/etanol 98% =100/10/220.
Bước 7: đặt vào -20oC ắt nhất trong 2h hoặc qua ựêm.
Bước 8: Ly tâm ở 13000 vòng/ phút, 4oC trong 15 phút, loại dịch. Bước 9: Rửa bằng cồn 70oC (ựể trong lạnh).
Bước 10: Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 4oC, loại bỏ dịch. Bước 11: Rửa bằng cồn 70oC (ựể trong lạnh).
Bước 12: Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 4oC, loại bỏ dịch. Bước 13: để khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng.
Bước 14: Bổ sung 16ộl H2O khử ion ựể hòa tan DNẠ
Sản phẩm cắt giới hạn ựó tinh sạch ựược ựiện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.3.2.2. Phương pháp ựiện di sản phẩm enzyme cắt giới hạn trên gel agarose
Bước 1: Chuẩn bị bản gel 1,2%: Cân 3,6g agarose hòa tan trong 300ml TAE 0,5x. Hòa tan hoàn toàn agarose trong TAE bằng ựun sôi trong lò vi sóng. để nguội ựến khoảng 60oC, tiến hành ựổ bản gel rồi ựể bản gel agarose ựông hoàn toàn.
Bước 2: Chạy ựiện di
- Chuẩn bị mẫu: + Trộn lẫn 14ộl DNA với 3ộl loading dye 6x. + Macker II
- Tra mẫu vào giếng. .
- Chạy ựiện di ở 80V trong vòng 3-4 giờ.
2.3.2.3. Chuẩn bị màng lai chứa sản phẩm enzyme cắt giới hạn
Sản phẩm enzyme cắt giới hạn ựược chuyển lên màng nitrocellulose theo phương pháp của Roche [53]. Cụ thể quy trình lên màng gồm các bước như sau:
Bước 1. điện di sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1,2% ở hiệu ựiện thể 80V trong 4 giờ.
Bước 1: Sau khi ựiện di thì rửa bản gel qua một lần với nước sạch Bước 2: Sau ựó rửa bản gel bằng 0,2M HCl
Bước 3: Rửa bản gel 2-3 lần với nước sạch
Bước 4: Rửa bản gel với 1,5M NaCl + 0,1M NaOH, rửa 2 lần. Bước 5: Rửa bản gel 2-3 lần với nước.
Bước 6: Rửa bản gel bằng neutralisation solution trong vòng 15 phút. Bước 7: Rửa bản gel 2-3 lần với nước.
Bước 8: Lên màng theo cấu trúc như sau: dung dịch ựệm 20xSSC sau ựó ựặt cầu nối Whatman lên trên thông qua tấm kắnh, tiếp theo là bản gel, màng lai, giấy thấm cuối cùng là vật nặng. Sau ựó ựể qua ựêm.
Bước 9: Lấy màng lai ra ngoài, ựể ráo nước, ựặt vào giữa 2 tờ whatman, sau ựó dùng giấy bạc gói kắn lạị Cho màng lai vào tủ 120oC trong vòng 20 phút.
Lai DNA với mẫu dò Dig-labelling theo quy trình chuẩn của Roche [53] Tiền laị
Bước 4: Làm ướt màng với 2xSSC và cho màng lai vào ống laị
Bước 5: Bổ sung 15ml/màng dung dịch lai hybridization 10% (42oC) vào ống laị Tiền lai ở 42 0C trong 6 giờ. Loại bỏ hoàn toàn dung dịch lai hybridization.
Laị
Bước 1: Biến tắnh 10 ộl mẫu dò ở 98oC trong 10 phút.
Bước 2: Bổ sung dung dịch hybridization với tỉ lệ 3ml hybridization/100cm2 màng lại vào ống lai, bổ sung 10 ộl mẫu dò ựó biến tắnh vào ống lai, lắc ựều rồi tiến hành lai ở 42oC qua ựêm.
Phát triển phim.
Bước 1: Rửa màng 2 lần, 15 phút với 2xSSC+0,1SDS ở 42oC.
Bước 2: Rửa màng bằng 50ml dung dịch (0,1xSSC + 0,1SDS) trong 15 ở 68oC, lặp lại 1 lần.
Bước 3: Rửa màng 1 phút trong 70ml buffer I (0,1 axit maleic +0,15M NaCl).
Bước 4: Rửa màng bằng 70ml buffer II (blokingregent1% +bufer I) trong 45 phút.
0,25ộl anti-dig).
Bước 6: Rửa màng 2 lần với wash buffer (buffer II +0,3% Tween 20), mỗi lần 70 ml wash buffer trong 20 phút.
Bước 7: Rửa màng 2 lần với 70ml buffer III ( 0,1 M Tris-HCl+0,1M NaCl, pH=9,5 ).
Bước 8: Phát triển phim với 10ộl dung dịch CDP-star (10ộl + 990ộl bufer III) và ủ phim trong phòng tốị
Bước 9: Rửa phim trong 500 ml dung dịch rửa phim ở trong phòng tốị
Bước 10: Hiển thị hình ảnh phim dưới ảnh sóng tự nhiên, ghi lại hình ảnh và phân tắch kết quả.
- Phương pháp phân tắch và xử lý số liệu: Số liệu ựược xử lý theo phương pháp thống kê và phần mềm Microsolf Excel 2003.
Chương 3