1.8.1 Vector nhị thể
Ti-plasmid của Ạtumefaciens ựã ựược nghiên cứu cải biến như cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng ựa năng, tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả như vector nhị thể (binary vector) và vector liên hợp (co intergrate vector). Nhờ vậy, cây trồng ựược biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường.
Nghiên cứu gần ựây của Olhoft và cộng sự (2003)[38] ựã thành công trong việc chuyển gen vào nốt lá mầm giống ựậu tương ỘBertỢ và các giống ựậu tương khác sử dụng hệ thống vector mới: vector liên hợp hai nguồn. Quy trình chuyển gen này có thể áp dụng ựể chuyển gen vào các giống ựậu tương khác nhau, thậm trắ cả các giống ựậu tương chọn lọc.
Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng T Ờ DNA mà vẫn ựiều khiển ựược sự chuyển và xâm nhập của T Ờ DNA vào hệ gen thực vật, người ta ựã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể, trong ựó vùng T Ờ DNA và vùng Vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng Agrobacterium tumefaciens.
Có hai loại vector ựược sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:
(a) Vector chuyển gen là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với ựoạn T Ờ DNA ựược cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới: i) các ựơn vị sao chép ựể DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả Ẹcoli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa nhiều ựiểm cắt của enzyme giới hạn (vùng tạo dòng ựa năng nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải ựể chèn gen mong muốn).
(b) Vector bổ trợ: nằm trong Agrobacterium tumefaciens, với toàn bộ vùng Vir ựược gữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vung T- DNA và RB, LB. Plasmid này ựược cải tiến loại bỏ gen kắch thắch tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai cấu trúc này cũng ựược ựưa vào Agrobacterium tumefaciens, khi các gen trên vector bổ trợ hoạt ựộng thì các sản phẩm của nó sẽ tác ựộng tới ựoạn T- DNA trên
vector chuyển gen dẫn ựến sự chuyển ựoạn T- DNA sang tế bào thực vật. Quá trình biến nạp ở vector nhị thể diễn ra như sau: (i) Plasmid nhỏ ựược nhân lên trong Ẹcoli, sau ựó ựược chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếp hợp vào tế bào Agrobacterium
tumefaciens ựể chuyển T- DNA vào genome thực vật; (ii) chọn lọc tế bào thực vật
trong những ựiều kiện thắch hợp.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai ựơn vị sao chép có thể không bền vững trong Ẹcoli khi cả hai vùng này cùng hoạt ựộng. Tuy nhiên, vector nhị thể có một số ưu ựiểm như: (i) không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; (ii) kắch thước của vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ Ẹcoli sang Agrobacterium
tumefaciens ựã tăng lên.