1.9.2.1. Northern blot
Phương pháp này gồm các bước cơ bản như sau [23]:
- Các mẫu RNA ( RNA tổng số hoặc mRNA) ựược phân tách bằng ựiên di trên gel agarosẹ
- Sau khi RNA ựược phân tách sẽ ựược chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trắ trên gel).
- Sau ựó RNA cố ựịnh trên màng lai ựược lai với mẫu dò sợi ựơn (có thể là DNA hoặc RNA) có ựánh dấu phóng xạ hoặc ựược gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.
- Vị trắ của mẫu dò ựược phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó ựược ựánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò ựược gắn với enzyme thì ựem ủ với một cơ chất không màụ Enzyme liên kết với nó sẽ biến ựổi thành sản phẩm màu có thể
nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ ựược phát hiện bằng phim Xquang một cách trực tiếp.
Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, xác ựịnh kắch thước, trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA trong các mẫu khác nhaụ đây là một phương pháp rất tốt ựể phân tắch sự biểu hiện của gen khi chúng ta cần ựịnh lượng ựể phân biệt sự khác nhau giữa hai mẫu và nó rất nhạy bởi vậy chúng ta có thể ựiện di một lượng lớn RNA tổng số hoặc mRNA trên gel.
1.9.2.2. Phương pháp RT-PCR (reverse transcriptase-PCR)
Reverse transcriptase-PCRlà kỹ thuật cho phép phát hiện rất nhanh sự biểu hiện mRNA trong cây chuyển gen. Về cơ bản ựây chắnh là kỹ thuật PCR nhưng khuôn ựể chạy phản ứng là cDNA ựược tổng hợp từ RNA tổng số. Phương pháp này sử dụng kết hợp enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase-RT) với PCR ựể khuyếch ựại RNẠ Phản ứng này sử dụng khả năng của enzyme sao chép ngược ựể sao chép RNA thành DNA bổ sung sợi ựơn và từ DNA bổ sung sợi ựơn thành DNA bổ sung sợi kép. Sau ựó DNA bổ sung sợi kép sẽ ựược khuyếch ựại nhờ Taq-polymerasẹ Sản phẩm của phản ứng RT-PCR là các phân tử DNA sợi kép tương ứng với phân tử RNA mẫụ Axit ribonucleic tế bào tổng số ựược tách chiết từ mô hoặc tế bào ựược sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng sao chép ngược [34].