CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. Tế bào gốc thần kinh (neural stem cell NSC)
1.2.4. Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh
Tế bào có thể được ni cấy ở dạng khối cầu (neurosphere) ở dạng huyền phù và nuôi cấy lớp đơn. Tế bào được duy trì trạng thái khơng biệt hóa bằng cách dùng nhiều mitogen khác nhau (thường dùng yếu tố sinh trưởng biểu mô (epithelial growth factor_EGF) hay yếu tố phát triển nguyên bào sợi (basis fibroblast growth factor_bFGF)) và được tăng sinh bằng cách phân tách cụm tế bào sơ cấp thành cụm tế bào thứ cấp.
NSC có thể ni cấy trong điều kiện huyết thanh và khơng có huyết thanh, dưới dạng lớp đơn hay các quả cầu neurosphere. Tế bào bám dính vào bề mặt dễ dàng biệt hóa nếu khơng có các mitogen. Tế bào dễ dàng biệt hóa trong mơi trường có huyết thanh và khơng có mitogen. Để tế bào bám tốt, bề mặt dụng cụ nuôi cần phủ các protein ngoại bào cần thiết như poly–L–lysin, fibronectin, polyornithine, thylene–co–vinyl alcohol. Các NSC phát triển ở nồng độ đường cao, cần bổ sung một số chất cần thiết cho chuyển hóa như putrescin, progesterone, transferin, insulin, selenium. Nguyên tắc quan trọng nhất trong nuôi cấy NSC là hệ thống ni cấy chọn lọc khơng huyết thanh, trong đó hầu hết các tế bào CNS đã biệt hóa sơ cấp bị loại trừ sau khi cho vào môi trường trong khi các tế bào gốc chưa biệt hóa bước vào trạng thái tăng sinh. Môi trường sử dụng là DMEM/F12, bổ sung với glucose, progesterone, putrescin, thành phần bổ sung B27, EGF, bFGF, ITSS (insulin – transferin – muối selenium) và heparin. Hỗn hợp của insulin, transferin, muối selenium, progesterone và putrescin còn gọi là yếu tố bổ sung N2. Hay nói cách khác, môi trường cho nuôi cấy các NSC cơ bản bao gồm DMEM/F12, bổ sung B27,
N2 và EGF, FGF. Hiện nay, trên thị trường đã có mơi trường thương mại hóa với các thành phần và hàm lượng khác nhau (Phan Kim Ngọc, 2009).
" Nuôi cấy neurosphere
Phương pháp này lần đầu tiên được đề xuất vào năm 1992 bởi Weiss và Reynolds. Việc thực hiện tương tự với nuôi cấy lớp đơn, ngoại trừ không bao phủ đĩa với các protein chất nền cần thiết cho sự bám dính. Trong điều kiện nói trên, một số tế bào đã biệt hóa bám vào đáy bình ni và chết sau 2 – 3 ngày trong khi chỉ ít tế bào tiền thân chưa biệt hóa bắt đầu tăng sinh. Các NSC sẽ phát triển thành các tập đồn trơi lơ lửng gọi là neurosphere. Nếu chuyển các neurosphere này sang mơi trường ni có huyết thanh, loại bỏ các mitogen thì chúng nhanh chóng biệt hóa thành các loại tế bào của hệ thần kinh.
Khoảng 10 – 50% tổng số tế bào được tạo ra giữ các đặc tính của tế bào gốc, phần tế bào cịn lại tự biệt hóa. Neurosphere là hỗn hợp của tế bào gốc, tế bào tiền thân đang biệt hóa, neuron và tế bào thần kinh đệm (Fedorrof và Richardson, 2001). Phương pháp này có nhiều ưu điểm. Sự phân bố tế bào bên trong neurosphere cung cấp vi môi trường rất tốt cho tế bào tiền thân tồn tại trong điều kiện in vitro (Bez và ctv, 2003). Tuy nhiên, hệ thống tế bào này bất lợi trong việc duy trì tính gốc của tế bào. Tế bào tiền thân bên trong neurosphere có khuynh hướng biệt hóa, tăng mức độ đa dạng của tế bào. Sự tương tác giữa tế bào đang biệt hóa và tế bào tiền thân có thể kích thích tế bào gốc tạo nhân tố biệt hóa (Windhorst và Johansson, 2011). Kích thước neurosphere tăng lên chứa nhiều quần thể tế bào gốc không đồng nhất với tế bào tiền thân phân chia nhanh chóng ở vùng rìa (Reynolds và Reitze, 2005) làm cho cụm tế bào phân tách (Harish Babu và ctv, 2011).
Hình 1. 6. Quy trình chung ni cấy và tăng sinh NSC trong điều kiện không huyết thanh (Fedorrof và Richardson, 2001).
" Nuôi cấy lớp đơn
Nuôi cấy lớp đơn các NSC cũng có thể đạt được trong môi trường không huyết thanh như trên và phủ các dụng cụ ni với các kích thích cho sự bám dính (thường sử dụng là poly–L–lysin hoặc kết hợp với laminin, hay fibronectin hoặc polyorrnithine). Poly–L–lysine được ủ với dụng với bình Roux để chúng bám vào bề mặt đĩa trước. Thực chất, đây là phương pháp nhằm tạo ra vi môi trường giống với trong não.
Trong trạng thái bám dính, với sự hiện diện của các mitogen như EGF, FGF thì các NSC tăng sinh khơng biệt hóa. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng phương pháp này khó giữ được trạng thái khơng biệt hóa của tế bào khi nuôi cấy trong thời gian dài.
Trong nuôi cấy lớp đơn, tế bào tiếp xúc đồng nhất với nhân tố tăng trưởng trong mơi trường do đó tế bào tăng sinh theo cách phân chia đối xứng và ức chế sự biệt hóa tự phát (Conti và Cattaneo, 2005). Ưu điểm tiếp theo của nuôi cấy lớp đơn là tế bào có thể được nghiên cứu và thao tác trực tiếp, hình thái học của mỗi tế bào
được quan sát rõ và tế bào tiếp xúc hồn tồn với mơi trường nội bào được kiểm sốt.
" Nuôi cấy neurosphere cải tiến
Phương pháp này do Xue – Sheng Zeng và cộng tác viên đề xuất vào năm 2007. Nhóm nghiên cứu sử dụng một chất bao phủ dụng cụ nuôi là gel agarose nhằm ngăn chặn sự bám dính của neurrosphere vào dụng cụ nuôi.
Theo kết quả công bố, việc sử dụng hệ thống ni cấy khơng bám dính bằng gel agarose có thể ni cấy tế bào NSC ít nhất suốt 3 tháng liền mà chúng không bị biệt hóa và khơng có hiện tượng bám dính xảy ra. Agarose không làm ảnh hưởng đến sự tăng sinh và khả năng biệt hóa của NSC sau này (Zeng và ctv, 2007).