Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1mg acid ganoderic A chuẩn cho vào bình định
mức 2 mL, hịa tan trong MeOH, siêu âm và điền MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. Pha lỗng để có dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ 200 ppm.
Dung dịch thử: Cao triterpenoid được xử lý bằng kỹ thuật SPE trước khi bơm vào hệ thống HPLC.
Điều kiện sắc ký
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-10AD Shimadzu (Nhật Bản) - Cột Shiseido 150 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm
- Pha động acetonitril-nước (29:71) + 3 giọt acid phosphoric - Phát hiện bằng UV 254nm - Tốc độ dòng 0,76 ml/phút - Áp suất 75 bar - Thể tích tiêm mẫu 20µl - Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phịng. 2.1..6. Phương pháp sắc kí lớp mỏng Điều kiện sắc kí: - Bản mỏng Silicagel 60F254 Merck - Hệ dung môi khai triển :
# N – butanol : acid acetic: nước (7:1:2)
- Thể tích chấm: 10 µl các dung dịch thử và 2 µl các dung dịch chuẩn.
- Phát hiện: Phun thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol 96%, sấy ở 105 0C đến khi xuất hiện vết và quan sát dưới ánh sáng thường.
Tiến hành:
− Dung dịch thử:
• Cao tổng cồn 96%: Cân 0,2g cao tổng hòa với 10ml cồn 96%, siêu âm nóng cho tan hết cắn. Dịch chiết được dùng làm dung dịch chấm sắc kí.
• Cao ether ethylic: Cân 0,5g cao ether ethylic hịa với 20ml cồn 96%,
siêu âm nóng 10 phút, lọc. Dịch lọc được dùng làm dung dịch chấm sắc kí.
• Cao n-butanol: Cân 0,5g cao n-butanol hịa với 20ml cồn 96%, siêu
âm nóng 10 phút, lọc. Dịch lọc được dùng làm dung dịch chấm sắc kí. • Cao nước: Cân 0,5g cao nước hịa với 20ml cồn 96%, siêu âm nóng
10 phút, lọc. Dịch lọc được dùng làm dung dịch chấm sắc kí. - Dung dịch chuẩn:
# Chuẩn M-R2: Hòa 1mg chuẩn M-R2 vào 10 ml ethanol 96%.
# Chuẩn G-Rg1: Hòa 1mg chuẩn G-Rg1 vào 10 ml ethanol 96%.
# Chuẩn G-Rb1: Hòa 1mg chuẩn G-Rb1 vào 10 ml ethanol 96%.
# Chuẩn G-Rd: Hòa 1mg chuẩn G-Rd vào 10 ml ethanol 96%.
2.2. Nội dung 2: Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh
Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não chuột
Giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc thần kinh người (dòng tế bào thương mại)
Đánh giả khả năng tăng sinh và tính gốc của tế bào trước khi tiến hành các thí nghiệm cảm ứng dược liệu
o Đánh giá thông qua khả năng tự làm mới. o Đánh giá thông qua marker bề mặt.
o Đánh giá thơng qua khả năng biệt hóa thành các loại tế bào chức năng.
2.2.1. Phương pháp thu nhận não thai chuột
Quy trình thực hiện:
(1) Thực hiện thao tác giết chuột mang thai (khoảng 14 ngày tuổi) bằng cách kéo giãn đốt sống cổ.
(2) Mở màng bụng bằng kéo và kẹp, xác định hai nhánh tử cung chuột.
(3) Cắt hai nhánh tử cung và chuyển vào hai falcon 15ml có chứa PBSA 10X, chuyển sang tủ vô trùng chuyên dùng nuôi cấy tế bào.
(4) Dùng kẹp chuyển các thai chuột sang dĩa petri.
(5) Tách các lớp nhau thai và màng ối bằng kéo và kẹp, chuyển các chuột thai sang becher mới.
(6) Rửa các thai chuột bằng PBSA 5X.
(7) Chuyển các thai sang dĩa petri mới, dùng kéo và kẹp tách phần đầu ra khỏi cơ thể chuột.
(8) Chuyển phần đầu thai chuột sang petri mới và rửa với PBSA 1X.
Hình 2. 4. Quy trình phân lập tế bào đơn từ não thai. (a) Thao tác giết chuột bằng
cách kéo giãn cột sống; (b) Thu nhận hai nhánh tử cung chuột; (c) Thu nhận chuột thai; (d) Tách mô từ não chuột; (e) Lọc để thu nhận tế bào đơn; (f) Ly tâm dung
dịch chứa tế bào đơn.
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột
Quy trình thực hiện:
(1) Dùng kéo nhỏ cắt nhuyễn mảnh mô.
(2) Hút tồn bộ mơ não chuột thu nhận vào falcon 15ml. (3) Rửa becher bằng 1ml PBS rồi chuyển vào falcon ở trên. (4) Huyền phù mạnh dung dịch trong falcon bằng pipet Pasteur. (5) Lọc dịch huyền phù tế bào bằng màng lọc 70µm.
(6) Hút huyền phù chứa tế bào vào ống ly tâm 15 ml (7) Ly tâm với tốc độ 2500 rpm (500g) trong 5 phút (8) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(9) Tái huyền phù cặn tế bào nhẹ nhàng với 2 ml SFM.
(10) Hút toàn bộ dịch tế bào chuyển vào bình Roux 25cm2 có tráng gel agarose. (11) Đặt bình ni trong tủ ni ở 37oC, 5% CO2.
2.2.3. Phương pháp cấy chuyền tế bào gốc thần kinh
Cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào để chúng tiếp tục tăng sinh và phát triển hiệu quả.
Quy trình thực hiện:
(1) Hút tồn bộ mơi trường trong bình Roux vào ống falcon 15ml. (2) Hút rửa bề mặt Roux bằng PBS và chuyển dịch rửa vào falcon trên. (3) Ly tâm 5 phút với tốc độ 2000 RPM.
(4) Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(5) Tái huyền phù nhẹ nhàng cặn tế bào trong 2 – 3 ml môi trường. (6) Chia đều huyền phù tế bào sang bình Roux mới.
(7) Ni cấy ở 370C, 5% CO2.
2.2.4. Phương pháp giải đơng, hoạt hóa tăng sinh tế bào thần kinh người (mua từ Lonza)
1. Lấy tế bào từ nitơ lỏng và cho vào bể ổn nhiệt 370C ngay lập tức, ngăn ngừa sự hình thành các tinh thể.
2. Nhanh chóng làm tan dịch tế bào trong ống đông lạnh bằng cách đảo đều vial trong bể ổn nhiệt 370C và chuyển vào tủ cấy khi hạt tinh thể đá cuối cùng tan ra, trung bình đưới 2 phút. Khơng nên dìm ống đơng lạnh hồn tồn trong nước. Khơng được để tan tế bào quá 2 phút.
3. Khi đã rã đông, chuyển ngay tế bào vào tube 50 ml vô trùng và cẩn thận bổ sung 4 ml môi trường SFM đã làm ấm (từng giọt, trung bình 1 giọt/giây) và đồng thời đảo đều tube.
4. Bổ sung 5 ml môi trường SFM đã làm ấm vào 1 tube khác.
5. Để loại bỏ chất bảo quản, ly tâm tube ở 200g, 4 phút và hút bỏ dịch nổi. 6. Tái huyền phù tế bào trong 2 ml môi trường SFM.
7. Xác định tế bào sống bằng cách nhuộm đếm với Trypan Blue. Số lượng tế bào sống phải trên 1x106 tế bào.
8. Chuyển dịch huyền phù tế bào vào đĩa nuôi cấy với mật độ (1,0x105 tế bào/cm2).
9. Chuyển đĩa nuôi vào tủ nuôi 370C, 5% CO2 để tế bào bám dính sau 24 giờ.
10. Qua ngày kế tiếp, thay môi trường mới cho tế bào.
11. Từ ngày 4 đến ngày 7, khi tế bào đã tăng sinh đạt mật độ khoảng 90%, có thể cấy truyền đến thế hệ cần thiết.
2.2.5. Phương pháp đánh giá khả năng tự làm mới của tế bào gốc ứng
viên
Dựa trên đặc điểm tăng sinh tự làm mới của tế bào gốc thần kinh, phương pháp đánh giá khả năng hình thành neurosphere của các tế bào ứng viên trên môi trường nuôi cấy khơng huyết thanh.
Quy trình thực hiện:
(1) Chọn bình Roux có chất lượng neurosphere tốt. (2) Hút môi trường chứa neurosphere sang falcon 15ml.
(3) Ly tâm ở tốc độ 2000 RPM trong 5 phút. (4) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(5) Thêm vào falcon 0,5ml dung dịch Trypsin/EDTA. (6) Ủ falcon trong bể ổn nhiệt ở 37oC, trong 3 phút.
(7) Thêm vào falcon 1 ml Trypsin Inhibitor, huyền phù nhẹ nhàng dịch tế bào.
(8) Ly tâm với tốc độ 2500 rpm. (9) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(10) Tái huyền phù cặn tế bào với 4 ml mơi trường ni cấy.
(11) Thu 100µl dịch huyền phù, xác định mật độ tế bào trong dung dịch. (12) Chuyển huyền phù tế bào sang đĩa nuôi tế bào 35mm với mật độ 5x103 tế
bào/ giếng.
(13) Quan sát đánh giá sự hình thành sphere mới có kích thước từ 50-100 µm.
2.2.6. Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có biểu hiện marker
chuyên biệt của tế bào gốc thần kinh
Marker chuyên biệt của tế bào gốc thần kinh được sử dụng trong đề tài là nestin. Nestin là marker biểu hiện trội trong các quần thể tế bào gốc hay tiền thân của hệ thống thần kinh trung ương. Tế bào ứng viên được nhuộm với kháng thể anti-nestin có gắn rhodamine và Hoechst 33342 theo qui trình của nhà sản xuất Santa Cruz Biotechnology, Inc, Hoa Kỳ. Tế bào ứng viên được nhuộm dưới dạng neurosphere.
(1) Thu nhận neurosphere vào ống ly tâm 15 ml.
(2) Bổ sung 1 ml dung dịch BSA 1% vào ống falcon có chứa neurosphere. (3) Ủ falcon trên máy lắc trong 10 phút.
(4) Bổ sung 2 ml PBS rửa tế bào.
(5) Bổ sung 100 µl dung dịch chạy Flow, bổ sung 900 µl PBS. Tái huyền phù tế bào nhẹ nhàng.
(6) Lắc nhẹ trong 30 phút trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. (7) Bổ sung 2 ml PBS rửa tế bào.
(8) Ly tâm dịch tế bào với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút. (9) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(11) Vortex nhẹ và lắc trên máy lắc trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. (12) Ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút.
(13) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(14) Bổ sung kháng thể FITC-anti-nestin và Hoechst 33342 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vortex trong vài phút.
(15) Lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, bọc giấy bạc tránh ánh sáng. (16) Bổ sung 2 ml PBS rửa tế bào. Tiến hành rửa 2 lần.
(17) Ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút. (18) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(19) Phân tích bằng máy Facs Calibur
2.2.7. Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có biểu hiện các gene
chuyên biệt của tế bào gốc thần kinh
Tách chiết RNA (Theo quy trình của easy-BLUE Total RNA Extraction Kit, Cat. No. 17061)
(1) Ly tâm thu nhận neurosphere cho trong eppendorf 2 ml.
(2) Cho 1ml Easy-BLUE vào epp, vortex mạnh trong 1 phút, ủ ở 4 oC trong 30 phút.
(3) Thêm vào 550 µl chloroform và vortex, ủ ở 4 oC trong 30 phút.
(4) Ly tâm 13000 vịng/phút 4oC 15p. Thu 500 µl lớp dung dịch ở trên cho vào 1 epp 1,5ml mới.
(5) Thêm isopropanol lạnh vào epp với tỉ lệ 1:1 và đảo 2-3 lần. Ủ ở -20 oC trong 40 phút.
(6) Ly tâm 13000 vòng/phút 4 oC 30 phút. Đổ bỏ dịch nổi thu tủa. (7) Cho vào ống ly tâm 1 ml Ethanol 70 %, đảo 2-3 lần.
(8) Ly tâm 13000 vòng/phút 4oC 15 phút. Bỏ dịch nổi, thu tủa. (9) Phơi khô tủa.
(10) Cho vào epp đã khơ 20 µl nước cất 2 lần. (11) Đo OD
QRT-PCR (Brilliant II Ultra-Fast SYBR Green)
(1) Cho các thành phần sau vào eppendort QRT-PCR:
o RNase block 1 µl o Mồi 1 µl o RNA 1 µl o Mix Brilliant 7,5 µl o H2O 4,5 µl - Tổng 15 µl
(2) Đặt phản ứng theo chu trình nhiệt: - RT o 50 oC 50 phút o 95 oC 3 phút - PCR 40 chu kì: o 95 oC 15 giây o 57 oC 30 giây o 72 oC 30 giây - Melting curve - Hold 4 oC (3) Xuất kết quả
(4) Cách tính biểu hiện gene theo công thức Livak 2^-ΔΔCt ΔCt (gen) = Ct (gen) – Ct (gadph)
ΔΔCt = ΔCt (gen nhóm thí nghiệm) - ΔCt (gen nhóm đối chứng)
2.2.8. Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có khả năng biệt hóa
thành tế bào astrocyte
Biệt hóa tế bào ứng viên thành tế bào astrocyte
Tế bào gốc thần kinh được nuôi trong môi trường không huyết thanh chuyên biệt để đảm bảo khơng có sự biệt hóa của tế bào. Phương pháp gây biệt hóa tế bào được chọn trong đề tài là phương pháp biệt hóa khơng định hướng khi bổ sung FBS trong mơi trường ni cấy.
Quy trình thực hiện:
(1) Hút mơi trường từ bình Roux chứa neurosphere có chất lượng tốt vào ống ly tâm 15 ml.
(2) Sử dụng mircopipet 100 µl huyền phù nhẹ nhàng dịch tế bào để thu huyền phù tế bào đơn.
(3) Ly tâm dịch tế bào với tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút. (4) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
(5) Thêm 2 ml mơi trường biệt hóa vào ống ly tâm, huyền phù nhẹ nhàng tạo thành dung dịch tế bào đơn.
(6) Chuyển dịch tế bào vào bình Roux có phủ Poly-L-Lysine. (7) Quan sát hình thái tế bào sau 7-10 ngày nuôi cấy.
Nhuộm tế bào bằng marker GFAP:
Tế bào sau khi nuôi cấy với môi trường biệt hóa được nhuộm hóa miễn dịch với kháng thể anti-GFAP có gắn rhodamine và Hoechst 33342. Quy trình nhuộm thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ Kit.
Qui trình thực hiện:
(1) Loại bỏ tồn bộ mơi trường trong bình Roux. (2) Tráng đều bề mặt Roux bằng PBS để rửa tế bào. (3) Bổ sung 1 ml dung dịch BSA 1% vào bình Roux. (4) Ủ bình Roux trong 10 phút.
(5) Tráng đều bề mặt Roux bằng PBS để rửa tế bào.
(6) Bổ sung 100 µl dung dịch chạy Flow 10X, bổ sung thêm 900 µl PBS, tráng đều bề mặt bình Roux.
(7) Ủ bình Roux trong 30 phút ở nhiệt độ phịng trên máy lắc.
(8) Tráng đều bề mặt Roux 2 lần bằng 2 ml PBS để rửa sạch dung dịch cố định FCM.
(9) Bổ sung kháng thể anti-GFAP có gắn rhodamine và Hoechst 33342 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vortex vài phút.
(10) Ủ 30 phút trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, bọc giấy bạc tránh ánh sáng. (11) Tráng đều bề mặt Roux bằng 2 ml PBS để rửa bề mặt.
2.3. Nội dung 3: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu lên khả năng tăng sinh của tế bào gốc thần kinh in vitro.
Tác động kích thích tăng sinh được đánh giá trên cơ sở thay đổi số lượng tế bào, thay đổi tốc độ tăng sinh, thay đổi chu kì tế bào khi bổ sung dược liệu so với không bổ sung dược liệu (đối chứng âm) và bổ sung nhân tố tăng trưởng thần kinh NGF.
" Nghiên cứu so sánh sự tác động của dược liệu ở các nồng độ khác nhau và một số chất kích thích tăng trưởng trên tế bào gốc thần kinh in vitro.
" Đánh giá khả năng tăng sinh bằng các phương pháp như: đo kích thước neurosphere, chu kì tế bào, đánh giá sự biểu hiện các gen liên quan đến chu kì tế bào bằng q-RT-PCR, đo đường cong tăng trưởng tế bào thực thời
Để tiến đánh giá hiệu quả tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu, tiến hành các thí nghiệm sau:
+ Thí nghiệm 1: Khảo sát tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau trên dòng tế bào gốc chuột (sử dụng NGF làm chất đối chứng dương, NGF: nhân tố phát triển thần kinh)
+ Thí nghiệm 2: Khảo sát tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau trên dòng tế bào gốc người (sử dụng NGF làm chất đối chứng dương, NGF: nhân tố phát triển thần kinh)
2.3.1. Đánh giá dựa trên kích thước neurosphere
Bố trí thí nghiệm
- Với mỗi phân đoạn cao chiết, thí nghiệm được bố trí trên đĩa 96 giếng với độ lặp lại của mỗi nghiệm thức là 10 lần. Sử dụng chứng âm là môi trường nuôi cấy không bổ sung dịch chiết.
- Quy trình thực hiện
(1) Cho vào các giếng môi trường nuôi cấy NCS có bổ sung các chất như sơ đồ bố trí thí nghiệm
(2) Chuyển các sphere có kích thước tương đồng từ 100-200 µm vào các giếng
(3) Đo kích thước neurosphere bằng phần mềm Axio Converter 1 lần /ngày vào giờ cố định, liên tiếp trong 5-7 ngày.
(4) Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel, tính độ lệch chuẩn bằng hàm STDEV (vùng số liệu).
2.3.2. Phương pháp đánh giá chu kì tế bào
1. Tế bào gốc thần kinh sau được cảm ứng bằng các cao chiết dược liệu, được tiến hành thu nhận bằng Trypsin-EDTA 0,25% và được cố định trong ethanol lạnh 70%, trữ ở 4oC và xử lý với 1mg/ml RNAse trong 30 phút ở 37oC.
2. DNA được đánh dấu bằng 20µg/ml PI trong tối 30 phút ở 4oC và hàm lượng DNA được đánh giá bằng flow cytometry Calibur sử dụng phần mềm CellQuest Pro.
3. Thí nghiệm phân tích được lập lại ba lần.
2.3.3. Phương pháp đánh giá sự biểu hiện các gen liên quan đến chu kì tế bào bằng q-RT-PCR (theo phương pháp 2.2.7)
Bảng 2. 1. Trình tự mồi sử dụng đánh giá gen liên quan đến chu trình tế bào
Tên gen Trình tự
ki67 [34] Forward: GCAGGAAGCAACAGATGAGAAGCC Reverse: GCTCAGGTGATACATGCCTCCTGC
cycA [51] Forward: GTTTCCCCAATGCTGGTTGA Reverse: AACCAAAATCCGTTGCTTCCT
cycD [17] Forward: CCAGAGGCGGATGAGAACAA Reverse: ATGGAGGGTGGGTTGGAAAT
cycC [54] Forward: CAGGACATGGGCCAGGAA
Reverse: TCCGTCCTGTAGGTATCATTCACTATC
2.3.4. Phương pháp đo đường cong tăng trưởng tế bào thực thời (Hệ
thống xCelligence)