CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.7. Mơ hình chuột bệnh Parkinson
Mơ hình động vật được sử dụng cho mục đích nghiên cứu các loại bệnh và cơ chế phân tử của các rối loạn trên người, đồng thời đánh giá tính hiệu quả của một phương pháp chữa trị tiềm năng, hay trong các thử nghiệm kiểm tra tính an tồn hoặc định liều cho một hợp chất có khả năng làm thuốc cho người. Tuy nhiên mơ hình động vật có một số hạn chế, chủ yếu là vì tính phức tạp của mơ hình khi biểu hiện cùng một loại bệnh, cũng như hiểu biết chưa đầy đủ về các rối loạn đó trên các lồi cấp thấp hơn [48]. Đối với mơ hình động vật mang bệnh thuộc hệ thần kinh trung ương của người (Alzheimer’s, Parkinson’s, Hungtington’s…) việc đánh giá trở nên khó khăn hơn nhiều vì có ít thơng tin về di truyền, cơ chế phân tử của bệnh được biểu hiện trên động vật [8, 10].
Trong khi mơ hình tế bào chỉ cung cấp thơng tin về q trình cụ thể, mơ hình động vật bệnh Parkinson cảm ứng bằng biến đổi di truyền hay chất độc thần kinh biểu hiện gần như toàn bộ các triệu chứng của bệnh nên rất hữu ích khi thử nghiệm các phương pháp bảo vệ hoặc phục hồi. Các phương pháp biến đổi di truyền trên động vật thường liên quan đến biểu hiện vượt mức protein α-synuclein hoặc đột biến gene park8 mã hóa cho LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2 – kinase chứa chuỗi
synuclein và tau (một protein đóng vai trị ổn định cấu trúc vi ống trong neuron), LRRK2 đột biến có thể dẫn đến sự tích tụ các protein mất chức năng và gây chết neuron . Bên cạnh đó, để có mơ hình động vật bệnh Parkinson cảm ứng dược chất (pharmacological-induced) người ta sử dụng các chất độc thần kinh, bao gồm 2 loại: chất độc cản trở sự tổng hợp dopamine, tác dụng trong thời gian ngắn như reserpine và alpha-methyl-para-tyrosine (AMPT); loại thứ 2 là chất độc tác động chọn lọc, có hiệu quả lâu dài. Chất độc tác động chọn lọc và lâu dài lên neuron tiết dopamine như methamphetamine, 6-hydroxydopamine (6-OHDA), 1-methyl-4-phenyl- 1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), rotenone, paraquat… được sử dụng rộng rãi hơn so với loại thứ nhất vì mơ phỏng gần giống nhất các rối loạn đặc trưng của bệnh Parkinson trên mơ hình động vật. Trong nhóm này 6-OHDA, MPTP được sử dụng phổ biến nhất, cụ thể là trên chuột và các linh trưởng không phải người. MPTP được ưu tiên sử dụng hơn so với các chất cịn lại trong nhóm bởi vì tác động gây chết chọn lọc được chứng minh qua nhiều nghiên cứu cùng với thao tác tiêm thuốc đơn giản, trong khi 6-OHDA cần được tiêm trực tiếp vào não và các chất độc khác chỉ biểu hiện một số triệu chứng nhất định của Parkinson.
MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) có cơng thức hóa học C12H15N và khối lượng phân tử 173.26 g/mol. Tác dụng gây Parkinson của MPTP được phát hiện một cách tình cờ khi 4 bệnh nhân nghiện có tuổi từ 26 đến 42 ở California, Hoa Kỳ biểu hiện nghiêm trọng các triệu chứngcủa bệnh Parkinson sau khi tiêm một hỗn hợp bao gồm MPPP (một chất giảm đau giống thuốc phiện) và sản phẩm phụ của nó sinh ra trong q trình tổng hợp là MPTP. Mặt khác, L-DOPA đã làm giảm triệu chứng Parkinson ở các bệnh nhân trên. Trong một nghiên cứu khác được tiến hành trên não một bệnh nhân đã chết mà trước đó đã tự tiêm hỗn hợp tương tự cho thấy sự mất tế bào ở vùng SNpc với độ nghiêm trọng tương đương với bệnh nhân Parkinson [41]. Sau đó, MPTP được sử dụng để gây ra các triệu chứng Parkinson trên một số lượng đa dạng các loài động vật, đến nay mơ hình được nghiên cứu phổ biến nhất là chuột và linh trưởng (khơng phải người). Đã có nhiều nghiên cứu thực hiện trên nhiều dòng chuột khác nhau cũng như với các nghiệm thức khác nhau cho thấy sự biến động trong mức độ nhạy cảm với MPTP. Tất cả chuột được sử dụng để tạo mơ hình bệnh Parkinson bằng MPTP đều là chuột đực,
đã có nghiên cứu chứng tỏ rằng estrogen có tác dụng bảo vệ thần kinh (neuroprotective properties) trong mơ hình gây độc lên neuron tiết dopamine ở thể vân [49]. Một nghiên cứu bởi Senedis và cộng sự thực hiện trên hai dòng chuột phổ biến là C57BL/6 và BALB/c với liều tiêm 15 mg/kg/liều x 4 liều MPTP được chuẩn bị dưới dạng MPTP.HCl cách quãng 2 giờ mỗi liều trong vòng 1 ngày cho kết quả dòng chuột C57BL/6 biểu hiện mức độ tổn thương ở vùng SNpc nhiều hơn (-85 %) so với dịng BALB/c (-58 %). Đánh giá hóa mơ miễn dịch (immunohistochemistry) cho thấy sự giảm biểu hiện tyrosine hydroxylase chỉ có ở vùng SNpc (-25 %) ở dịng C57BL/6, tuy nhiên khơng có sự khác biệt giữa nhóm đối chứng được tiêm nước muối sinh lý và nhóm thí nghiệm ở dịng BALB/c [49]. Cũng tương tự như ở bệnh Parkinson tự nhiên, MPTP chỉ ảnh hưởng chuyên biệt lên vùng SNpc hơn là neuron tiết dopamine ở vùng mái não thất. Trong một nghiên cứu khác thực hiện bởi Sonsalla và Heikkila khi so sánh nồng độ dopamine trong não giữa hai chủng chuột C57BL và Swiss Webster cũng chỉ ra rằng chuột C57BL nhạy cảm với MPTP (20 mg/kg/liều x 4 liều cách quãng 2 giờ trong 1 ngày) với sự giảm 95 % nồng độ dopamine so với chuột đối chứng, tuy nhiên tỉ lệ giảm này ở chuột Swiss Webster chỉ là 59 % [49]. Cũng trong nghiên cứu này, tỉ lệ chết 100 % được ghi nhận ở việc tiêm 20 mg/kg/liều x 4 liều cách quãng 2 giờ trong 1 ngày ở cả 2 chủng chuột, và 0 % đối với liều 10 mg/kg/liều x 4 liều cách quãng 2 giờ trong 1 ngày.
Mặt khác, một nghiên cứu về sự biểu hiện tyrosine hydroxylase ở mức độ phiên mã được thực hiện trên dòng chuột C57BL/6 được tiêm MPTP với liều 12 mg/kg/liều lần lượt với 2 hoặc 4 liều trong một ngày với thời gian cách quãng 2 giờ bằng phương pháp Realtime RT-PCR chỉ ra rằng ở thời điểm 2 tuần sau khi tiêm liều cuối cùng, mặc dù có sự giảm nồng độ dopamine 50 % ở nhóm chuột được tiêm 2 liều/ngày, hàm lượng mRNA của tyrosine hydroxylase trong vùng chất đen khơng có sự thay đổi mang ý nghĩa thống kê (p > 0.05) so với nhóm đối chứng được tiêm dung dịch nước muối sinh lý. Tuy nhiên, nhóm chuột được tiêm 4 liều/ngày biểu hiện hàm lượng mRNA tyrosine hydroxylase thấp hơn 50 % so với nhóm đối chứng. Đồng thời, biểu hiện hành vi vận động cũng được khảo sát và khơng có sự khác nhau về các phương diện như độ dài bước chân hay thời gian nghỉ ngơi khi so sánh giữa nhóm được tiêm 2 liều/ngày và nhóm đối chứng. Sự giảm thiểu 30-40 %
điểm đánh giá trong các chỉ tiêu vận động, mặt khác, lại được ghi nhận ở nhóm được tiêm 4 liều/ngày so với nhóm đối chứng [39]. Nghiên cứu chỉ ra phản ứng “bù trừ” (compensatory) của những tế bào tiết dopamine còn lại sau khi bị ảnh hưởng bởi MPTP ở giai đoạn trước khi có triệu chứng và giai đoạn sớm khi bắt đầu có dấu hiệu của bệnh Parkinson. Hai giai đoạn này tương ứng với giai đoạn trước khi biểu hiện triệu chứng và giai đoạn sớm của bệnh trên người, trong đó nghiên cứu đặt ra các giả thuyết bao gồm (i) tồn tại một ngưỡng bắt đầu có sự chết đi của các neuron tiết dopamine ở vùng SNpc và mất đi sự truyền tín hiệu đến thể vân, (ii) giai đoạn tiếp theo là sự cạn kiệt không thể bù đắp của nồng độ dopamine ở thể vân, cuối cùng (iii) là giai đoạn bắt đầu biểu hiện triệu chứng Parkinson [39]. Tác động của MPTP lên chuột được đánh giá sau 2 tuần căn cứ vào bằng chứng cung cấp bởi các nghiên cứu trước đó chỉ ra các neuron tiết dopamine ở vùng SNpc chết đi trong vòng 5 ngày sau khi tiêm, và theo sau là quá trình hồi phục bù đắp của não bộ
Cơ chế hoạt động và dược động lực học của MPTP
Hình 1. 7. Cơ chế gây độc của MPTP thông qua sự hình thành MPP+
Bản thân MPTP khơng có tính độc thần kinh mà là sản phẩm chuyển hóa của nó. Bản chất kỵ nước giúp phân tử MPTP có thể khuếch tán tự do qua hàng rào máu não. Sau đó MPTP được chuyển hóa thành MPP+ bởi enzyme monoamine oxidase B (MAO-B) trong tế bào đệm và được giải phóng ra khơng gian ngoại bào [23]. Khơng giống như MPTP, ion MPP+ khơng có khả năng khuếch tán tự do qua màng sinh chất mà được hấp thu chủ yếu bởi kênh vận chuyển dopamine (dopamine
transporter – DAT) do có ái lực cao với kênh này. Sau khi đi vào tế bào, MPP+ tích tụ vào các bóng synapse hoặc ti thể. Các thí nghiệm trên chuột sử dụng các chất ức chế MAO-B (như deprenyl) hoặc DAT (mazindol) ngăn cản sự tạo thành và hấp thu MPP+ làm mất tính độc của MPTP [36].
MPP+ tác động lên nhiều con đường chuyển hóa bình thường trong tế bào. MPP+ ức chế phức hệ I (complex I) trong chuỗi truyền điện tử và ức chế sự tạo thành ATP, gia tăng sự hình thành các gốc oxy tự do (reactive oxygen species – ROS), cuối cùng gây chết neuron. Sự gia tăng các gốc oxy tự do gây hư hại màng ti thể và giải phóng cytochrome C. Ngồi ra, sự giải phóng các gốc tự do từ ti thể cũng gây hư hỏng màng tế bào, đứt gãy DNA và kích hoạt con đường gây apoptosis thông qua ti thể bởi protein p53. Đồng thời, MPP+ còn ức chế hoạt động của tyrosine hydroxylase, L-AADC, MAO trong con đường tổng hợp và chuyển hóa dopamine kìm hãm q trình tổng hợp dopamine .
Sự phân bố: Sau khi tiêm, MPTP và MPP+ tập trung chủ yếu ở tim, sau đó là gan;
hầu như nồng độ của chúng khơng có sự khác biệt giữa não và phổi, và nồng độ MPTP và chất chuyển hóa thấp nhất ở thận. Nghiên cứu trên dòng chuột CRL/CFW, cân nặng từ 20-30gr thực hiện bởi Fuller và Hemrick-Luecke cho thấy MPTP được tiêm dưới da có nồng độ MPP+ tại não và các cơ quan ngoại vi là cao hơn nhiều so với việc cho qua đường miệng [24].
Chuyển hóa: Khảo sát tiêm MPTP dưới màng bụng cho thấy MPTP được hấp thu
chủ yếu qua tĩnh mạch cửa gan hơn là qua mao mạch và bị đào thải tích cực bởi
hoạt động của hệ enzyme P450. 2 ngày sau khi tiêm MPTP, 70 % tổng liều MPTP
và các chất chuyển hóa được thu nhận lại từ nước rửa chuồng, nước tiểu và phân, trong đó 15 % ở chuột và 2 % ở khỉ là MPTP khơng chuyển hóa, phần cịn lại là sản phẩm chuyển hóa như MPP+. Hơn nữa, sự bài tiết MPTP diễn ra chủ yếu trong ngày đầu sau tiêm thuốc, trong khi các chất chuyển hóa từ MPTP được bài tiết chủ yếu trong vòng 3 ngày sau tiêm. Khơng có bằng chứng ở cả chuột và khỉ cho thấy MPTP và sản phẩm chuyển hóa vẫn được bài xuất sau 3 ngày sau tiêm. Mặc dù MPTP tích tụ trong dịch mật, con đường bài xuất MPTP chủ yếu là từ nước tiểu. Tất cả MPTP trong nước tiểu gần như được ion hóa và khơng bay hơi, và được hấp
thụ hồn tồn bởi chất lót chuồng. Tương tự, ít hơn 0.01 % tổng liều MPTP được phát hiện dưới dạng bay hơi bắt nguồn từ hơi thở cũng như nước tiểu.