CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. Nội dung 5: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh, biệt hóa của các dược
3.5.1. Kết quả xây dựng mơ hình chuột bệnh Parkinson
3.5.1.1. Kết quả thiết lập quy trình đánh giá số lượng tế bào trong vùng não giữa chứa vùng SNpc
Chọn 5 chuột bình thường, khỏe mạnh và cắt lát mô não. Mỗi não thu nhận 5 lát cắt. Trước khi thu nhận các lát cắt để sử dụng cho nhuộm hóa mơ miễn dịch, một vài lát có thể được nhuộm H&E và so sánh với atlas não chuột của hệ thống Reference Atlas :: Allen Brain Atlas : Mouse Brain. Sau khi nhuộm hóa mơ miễn dịch, hình ảnh của mỗi lát được ghi nhận bằng hệ thống kính hiển vi huỳnh quang AxioVision tại các bước sóng và kính lọc DAPI (cho thấy nhân tế bào) và FITC (cho thấy tế bào dương tính với TH phát huỳnh quang AlexaFluor® 488). Các thị trường chụp quần thể tế bào ở vùng não giữa (bao gồm cả vùng SNpc) được phân tích bằng phần mềm Image J 1.49v để đo đường kính tương đối của nhân tế bào một cách thủ công dưới dạng điểm ảnh (pixel) và đếm số lượng tế bào tương đối dựa vào số lượng nhân thơng qua đường kính trung bình với công cụ ITCN (Image-based Tool for Counting Nuclei – Cơng cụ đếm nhân tế bào dựa trên hình ảnh).
A
B
Hình 3. 21. A. Lát mô được nhuộm H&E và so sánh với Atlas não chuột. Mũi tên chỉ ra vùng SNpc B. Quần thể tế bào tiết dopamine ở vùng SNpc ở độ phóng đại x100. Từ trên xuống: Nhân tế bào được nhuộm với Hoechst 33258 phát huỳnh quang màu xanh dương, Tế bào tiết dopamine dương tính với TH phát huỳnh quang màu xanh lá FITC, Chồng hai ảnh huỳnh quang
Thiết lập các giá trị “ngưỡng” (threshold) cho công cụ ITCN lần lượt bằng 0.4, 0.8, 1.8 và 2 cho các lần đếm thử. Một vùng ngẫu nhiên nằm trong vùng SNpc và khu vực lân cận được chọn trước để phần mềm phân tích, đồng thời một người khác khơng biết trước về thí nghiệm sẽ đếm một cách thủ công trên cùng 1 vùng. Kết quả số lượng tế bào từ phần mềm và đếm thủ công sẽ được so sánh để chọn ra giá trị ngưỡng phù hợp.
- Đường kính tế bào trung bình (pixel) đo được: 10.88 pixel ~ 11 pixel (tương đương với ~10.89 µm)
- Số lượng tế bào đếm được trong vùng đã chọn bằng cách đếm thủ công so với đếm bằng ITCN với các giá trị ngưỡng được thiết lập
Bảng 3. 7. Kết quả đếm tế bào để khảo sát giá trị ngưỡng ban đầu
Bảng 3. 8. Kết quả đếm tế bào để khảo sát giá trị ngưỡng (1)
vùng ngẫu nhiên 1
Đếm tay ITCN tỉ lệ khác biệt %
Ngưỡng = 1 22 21 4.55
Vùng 1 (có tín hiệu huỳnh quang rõ)
Đếm tay ITCN tỉ lệ khác biệt %
Ngưỡng = 0.4 15 17 13.33 Ngưỡng = 0.8 17 13.33 Ngưỡng = 1 17 13.33 Ngưỡng = 1.8 15 0.00 Ngưỡng = 2 15 0.00
Vùng 2 (vùng có tín hiệu huỳnh quang yếu) Ngưỡng = 0.4 14 19 35.71 Ngưỡng = 0.8 19 35.71 Ngưỡng = 1 16 14.29 Ngưỡng = 1.8 11 21.43 Ngưỡng = 2 9 35.71
Ngưỡng = 1.8 21 4.55
Ngưỡng = 2 21 4.55
Bảng 3. 9. Kết quả đếm tế bào để khảo sát giá trị ngưỡng (2)
Bảng 3. 10. Kết quả đếm tế bào để khảo sát giá trị ngưỡng (3)
Thử nghiệm ở vùng nhân tế bào phát tín hiệu huỳnh quang mạnh của Hoechst cho thấy các giá trị ngưỡng từ 0.4 đến 2 không cho sự khác biệt rõ ràng khi phần mềm nhận diện tế bào (Bảng 3.7). Tuy nhiên, khi sử dụng hình ảnh chụp các tế bào bắt thuốc nhuộm không tốt và phát huỳnh quang yếu thì kết quả cho thấy các giá trị threshold 0.4 và 0.8 cho kết quả đếm sai lệch nhiều hơn các giá trị ngưỡng = 1 và 1.8 (Bảng 3.7).
Tiếp tục thử nghiệm thiết lập các thông số ngưỡng = 1, 1.8 và 2 để phần mềm đếm tế bào ở 3 vùng nhân tế bào được chọn ngẫu nhiên khác, kết quả so sánh chỉ ra giá trị ngưỡng = 1 và 1.8 cho phép chương trình xác định tế bào tương đối ổn định với tỉ lệ khác biệt so với đếm thủ công dưới 5 % trong 2 lần. Giá trị ngưỡng = 2 vẫn cho kết quả nhận diện khá tốt khi sự chênh lệch vẫn dưới 10 %. Tuy nhiên, vẫn có sự biến động khi áp dụng lên các vùng nhân tế bào khác (Bảng 3.8 đến 3.11).
vùng ngẫu nhiên 2
Đếm tay ITCN tỉ lệ khác biệt %
Ngưỡng = 1 45 47 4.44 Ngưỡng = 1.8 44 2.22 Ngưỡng = 2 41 8.89 vùng ngẫu nhiên 3
Đếm tay ITCN tỉ lệ khác biệt %
Ngưỡng = 1
37
40 8.11
Ngưỡng = 1.8 33 26.67
3.5.1.2. Kết quả tạo mơ hình
" Tỉ lệ sống sót của các nhóm chuột sau khi được tiêm MPTP ở các nghiệm thức cấp tính:
Bảng 3. 11. Kết quả theo dõi tỉ lệ sống của chuột ở các lơ thí nghiệm
Nhóm (6 con/nhóm) Tỉ lệ sống sót sau khi tiêm Liều cấp tính (4 liều cách khoảng 2 giờ đồng hồ)
- 10 mg/kg/liều 100% chuột sống sót sau 4 liều tiêm 16 mg/kg/liều 100%: chuột chết sau 2 liều tiêm - 18 mg/kg/liều
-
100%: chuột chết ngay sau liều tiêm đầu tiên
Liều cận cấp tính
15 mg/kg/liều/ngày x8 ngày
100 % chuột sống
Từ kết quả trên, chúng tôi chọn liều 10 mg/kg/liều là liều cấp tính và 15 mg/kg là liều cận cấp tính cho các đánh giá tiếp theo.
" Kết quả đánh giá cấu trúc mô học và tế bào hoại tử ở vùng chất
A B
Hình 3. 22. A. Mẫu não sau khi thu nhận để cắt lát; B. Khối mô não được chuẩn bị để cắt lát mô lạnh
A B C
D E F
G H I
K L M
Hình 3. 23. Kết quả nhuộm hóa mơ miễn dịch tế bào tiết dopamine trong vùng
SNpc dương tính với TH phát huỳnh quang xanh lục của Alexa Fluor® 488, nhân
tế bào phát huỳnh quanh xanh lam của Hoechst 33258. Lần lượt từ trái qua phải theo hàng ngang là nhân tế bào, tế bào tiết dopamine dương tính với TH và hình gộp chung hai thị trường. Các nhóm bao gồm (A,B,C): chuột được tiêm PBS (nhóm
P); (D,E,F): chuột thường; (G,H,I): chuột được tiêm MPTP liều 10 mg/kg/liều, (K,L,M): chuột được tiêm MPTP với liều cận cấp tính 15 mg/kg/liều/ngày x 8 ngày
ANOVA table SS DF MS F (DFn, DFd) P value
Treatment (between
columns) 271.9 3 90.62 F (3, 9) = 5.138 P = 0.0242 Residual (within
columns) 158.7 9 17.64
Total 430.6 12
Hình 3. 24. Biểu đồ so sánh tỉ lệ neuron tiết dopamine với tổng số tế bào đếm được trong thị trường ở 4 nhóm chuột (P. Nhóm tiêm PBS, C. tiêm MPTP với liều cấp tính 10 mg/kg/liều/ngày x 4 ngày; C*. MPTP với liều cận cấp tính 15 mg/kg/liều/ngày x 8 ngày), B. Phân tích One-way ANOVA cho dữ liệu thu được
Phân tích mật độ neuron tiết dopamine ở vùng chất đen (Substantia nigra pars compacta) bằng công cụ ITCN của phần mềm ImageJ 1.49v cho thấy khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm chuột bình thường, được tiêm PBS và nhóm chuột được tiêm MPTP với liều cấp tính 10 mg/kg/liều x 4 liều/ngày. Tuy nhiên, liều cận cấp tính 15 mg/kg/liều/ngày x 8 ngày dẫn đến kết quả giảm mức độ tế bào dương tính với Tyrosine Hydroxylase xấp xỉ 1.7 lần so với nhóm P với p- value = 0.00242. Do đó, chúng tơi chọn liều cận cấp tính (15 mg/kg/liều/ngày x 8 ngày) để tiến hành phân tích các đặc điểm của Parkinson ở mức độ phân tử, tế bào và hành vi. Liều cận cấp tính (15mg/kg) là liều có tác động lên vùng chất đen của não chuột.
A
" Kết quả đánh giá hành vi vận động
Sau 13 ngày kể từ ngày ghi nhận dữ liệu hành vi vận động lần cuối cùng, tất cả các chuột ở nhóm thí nghiệm được ghi nhận hành vi vận động lần thứ 2. Việc ghi nhận dữ liệu được tiến hành trong 2 ngày 13 và 14.
Hình 3. 25. Kết quả đánh giá biểu hiện hành vi vận động của chuột ở các nhóm thí nghiệm thơng qua khoảng cách bước chân trung bình (mm/bước chân)
Phương pháp phân tích thống kê t-test bắt cặp (paired t-test) bằng phần mềm Graphpad Prism ver 6.05 được sử dụng để so sánh hành vi vận động dưới dạng khoảng cách trung bình của mỗi bước chân (mm) của các chuột ở các nhóm thí nghiệm trước và sau khi tiêm PBS/không tiêm /MPTP. Kết quả phân tích cho thấy:
Khơng có sự khác biệt có tính thống kê với độ tin cậy 95 % giữa khoảng cách trung bình của mỗi bước chân của các chuột ở các nhóm được tiêm PBS (nhóm P), khơng tiêm (chuột thường) và được tiêm MPTP với liều cấp tính (nhóm C), và ở cả nhóm được tiêm MPTP với liều cận cấp tính 15 mg/kg/ngày kéo dài trong vịng 8 ngày (nhóm C*) trước và sau khi tiêm.
" Kết quả đánh giá số lượng tế bào hoại tử trong vùng chất đen
Hình 3. 26. A. Biểu đồ so sánh tỉ lệ tế bào bị hoại tử (necrosis) dương tính với PI trong quần thể tế bào thu nhận từ vùng não giữa ở các nhóm chuột bằng phương pháp Flow cytometry, B. Phân tích One-way ANOVA cho dữ liệu thu được
Kết quả phân tích cho thấy, nhóm chuột tiêm MPTP liều cận cấp tính (15mg/kg, nhóm C*) gây ra sự hoại tử tế bào ở vùng chất đen. Kết quả khác biệt so với đối chứng (p<0.0001).
" Mức độ biểu hiện gene th ở nhóm chuột được tiêm MPTP
Kết quả đánh giá biểu hiện gene th cho thấy, nhóm chuột được xử lý MPTP giảm biểu hiện gene th so với nhóm đối chứng (lane a và c trên 3.22)
Gene gadph
Gene th
a b1 b2 b3 c
Hình 3. 27. Phân tích mức độ biểu hiện gene th ở các nhóm chuột bằng phương pháp RT-PCR kết hợp với so sánh độ sáng vạch điện di; trong đó a-nhóm chuột
thường, b1, b2, b3-nhóm chuột tiêm MPTP với liều cận cấp tính được cho uống cao cồn tổng sâm Ngọc Linh, c-nhóm chuột tiêm MPTP với liều cận cấp tính được cho
3.5.2. Kết quả đánh giá hiệu quả hồi phục của mơ hình chuột tiêm MPTP với liều cận cấp tính 15 mg/kg/liều/ngày x 8 ngày được cho uống cao cồn tổng sâm Ngọc Linh
" Tỉ lệ sống sót của các nhóm chuột sau khi được tiêm MPTP ở các nghiệm
thức
Kết quả ghi nhận cho thấy tỉ lệ sống sót 100% đối với chuột tiêm MPTP với liều cận cấp tính 15 mg/kg/liều/ngày x 8 ngày được cho uống cao cồn tổng sâm Ngọc Linh với liều 500 mg/kg/liều/ngày kéo dài 5 ngày trước khi tiêm MPTP và được cho uống tiếp tục 5 ngày với cách quãng 5 ngày kể từ liều tiêm MPTP cuối cùng.
" Kết quả đánh giá cấu trúc mô học
A ANOVA table SS DF MS F (DFn, DFd) P value Treatment (between columns) 312.0 3 104.0 F (3, 9) = 4.605 P = 0.0324 Residual (within columns) 203.3 9 22.59 Total 515.3 12
Hình 3. 28. A. Đánh giá số lượng neuron tiết dopamine trong vùng chất đen ở các nhóm chuột B. Bảng phân tích One-way ANOVA từ dữ liệu thu được
Kết quả đếm tế bào phát huỳnh quang FITC tại vùng chất đen SNpc (Substantia nigra pars compacta) của các nhóm chuột chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0.0324) giữa các nhóm chuột được tiêm MPTP liều cận cấp tính với các nhóm chuột đối chứng. Tuy nhiên, khơng có bằng chứng cho thấy sự khác biệt giữa 2 nhóm được tiêm MPTP có sử dụng cao chiết Sâm cồn tổng.
" Kết quả đánh giá hành vi vận động
Hình 3. 29. Kết quả đánh giá biểu hiện hành vi vận động của chuột ở các nhóm thí nghiệm thơng qua khoảng cách bước chân trung bình (mm/bước chân)
Phân tích paired t-test cho dữ liệu hành vi vận động được thể hiện dưới dạng khoảng cách trung bình của 2 chân trước ở các nhóm chuột trước và sau khi được tiêm thuốc hoặc cho uống cao chiết Sâm cồn Ngọc Linh tổng cho thấy khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các lần trước và sau ở các nhóm chuột.
" Kết quả đánh giá số lượng tế bào hoại tử trong vùng chất đen A. B ANOVA table SS DF MS F (DFn, DFd) P value Treatment (between columns) 3671 2 1835 F (2, 6) = 3330 P < 0.0001 Residual (within columns) 3.307 6 0.5511 Total 3674 8
Hình 3. 30. Biểu đồ so sánh tỉ lệ tế bào bị hoại tử (necrosis) dương tính với PI trong quần thể tế bào thu nhận từ vùng não giữa ở các nhóm chuột thử sâm cồn bằng phương pháp Flow cytometry, B. Phân tích One-way ANOVA cho dữ liệu thu được
" Mức độ biểu hiện gene th ở nhóm chuột được tiêm MPTP
! ! ! ! ! !
Gene gadph
Gene th
Hình 3. 31. Phân tích mức độ biểu hiện gene th ở các nhóm chuột bằng phương pháp RT-PCR kết hợp với so sánh độ sáng vạch điện di; trong đó a-nhóm chuột
thường, b1, b2, b3-nhóm chuột tiêm MPTP với liều cận cấp tính được cho uống cao cồn tổng sâm Ngọc Linh, c-nhóm chuột tiêm MPTP với liều cận cấp tính được cho
uống dung môi pha cao.
Bàn luận:
Trong thí nghiệm này, quan sát được sự giảm mật độ neuron tiết dopamine ở các nhóm chuột được tiêm MPTP ở cả liều cấp tính và cận cấp tính. Tuy nhiên ở mức độ mô học và hành vi, nhóm chuột được tiêm MPTP với liều cấp tính 10 mg/kg/liều x 4 liều/ngày khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nhóm chuột đối chứng. Có thể đặt ra giả thuyết dựa trên hiện tượng viêm trong hệ thần kinh (neuroinflammation) mà được coi là yếu tố chủ yếu dẫn đến sự chết của các neuron trong các bệnh suy thối thần kinh, trong đó có Parkinson như sau. MPTP đã tạo ra
hiện tượng viêm trong vùng não giữa, một số lượng nhất định các neuron tiết dopamine bị thương tổn dưới tác động của MPP+ dẫn đến sự suy giảm mật độ axon từ vùng chất đen đến thể vân. Sự phục hồi các khu vực bị thương tổn dưới tác động của MPP+ trong khoảng thời gian 14-30 ngày sau khi tiêm diễn ra nhanh chóng ở chuột trẻ (2-3 tháng tuổi) đối với dòng chuột C57BL/6 [16]. Phản ứng “bù trừ” của não bộ trước sự hao hụt dopamine cấp tính ở thể vân do thương tổn ở SNpc còn bao gồm sự phóng chiếu axon “bù trừ” đến từ quần thể neuron tiết dopamine ở vùng mái não thất, mặc dù trong điều kiện bình thường 2 quần thể neuron này truyền tín hiệu dopamine đến 2 vùng riêng biệt [28]. Như vậy. có thể hoạt động bù trừ của não bộ đã thích nghi được với sự giảm không đáng kể số lượng neuron tiết dopamine, đồng thời sự tích tụ MPTP đã khơng đủ để gây ra trạng thái viêm kéo dài từ đó gây chết một số lượng lớn tế bào. Đối với nhóm chuột được tiêm MPTP với liều cận cấp tính 15 mg/kg/liều/ngày x 8 ngày, sự xuất hiện quần thể tế bào bị hoại tử (necrosis) dương tính với PI lên đến 59.9% kết hợp với sự giảm biểu hiện ở mức độ phiên mã của gene th, đồng thời với sự giảm mật độ tế bào dương tính với tyrosine hydroxylase có ý nghĩa thống kê đã chứng tỏ nồng độ MPTP tương đối cao (gần bằng với liều gây chết trong bước kiểm tra ban đầu) và được đưa vào cơ thể chuột kéo dài có khả năng đã vượt quá giới hạn tự phục hồi của não bộ.
Cơ chế gây độc thần kinh của MPTP được chứng minh là thơng qua q trình gây stress oxy hóa dẫn đến sự chết neuron tiết dopamine [23]. Việc sử dụng nhân sâm, mà thành phần gồm có các ginsenoside Rg1 có tác động kháng viêm thông qua việc ức chế NF-κB/p65 cũng như caspase-3 là một tín hiệu cho q trình apoptosis [13]. Trong mơ hình chuột Parkinson cảm ứng bằng MPTP, Rg1 có khả năng bảo vệ các neuron tiết dopamine [69] đồng thời cũng tăng cường biểu hiện các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp dopamine ở mức độ phiên mã như th mRNA (tyrosine hydroxylase) và DAT mRNA (dopamine transporter) [70]. Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi quan sát thấy sự tăng cường biểu hiện mRNA của tyrosine hydroxylase ở nhóm chuột được tiêm MPTP ở liều cận cấp tính được cho sử dụng cao cồn Sâm Ngọc Linh tổng với liều 500 mg/kg/ngày kéo dài trong vòng 5 ngày so với nhóm chuột chỉ được cho uống dung mơi pha cao. Tuy nhiên, khơng có sự khác