1.2.2. Các vị trí thu nhận NSC
Mặc dù nhiều tế bào trong hệ thống thần kinh động vật có vú được sinh ra trong giai đoạn phơi thai và mới sinh, tế bào thần kinh mới liên tục được bổ sung vào những vùng của não trưởng thành (Altman và Das, 1965). Trong não của động vật có vú trưởng thành, NSC (hay các tế bào giống NSC) tham gia quá trình phát triển hệ thần kinh dưới các điều kiện sinh lí, tại một số vị trí đặc biệt là vùng SVZ (subventricular zone) của não thất bên, vùng SGZ (subgranular zone) của vùng hồi hải mã và hành khứu giác. Vùng SVZ có tốc độ tạo tế bào thần kinh cao nhất, nơi đầu tiên NSC được phân lập bởi Weiss và Reynolds vào năm 1992.
Ngồi ra, NSC cịn được tìm thấy ở nếp nhăn vỏ não, mấu khứu giác, vùng chất xám, vùng chất đen và tủy sống. NSC hiện diện từ giai đoạn phơi thai và được
duy trì suốt đời suốt cuộc đời. Phụ thuộc v ào giai đoạn phát triển, chu kì ngun phân của các NSC có thể từ 7 – 10 giờ trong thai, đến 18 giờ trong thời kì thai muộn và vài ngày trong cơ thể trưởng thành (Weiner, 2008).
Hình 1. 5. Các vị trí thu nhận NSC ở động vật có vú (Temple, 2001).
1.2.3. Ứng dụng tế bào gốc thần kinh
" Liệu pháp tế bào điều trị các bệnh thối hóa thần kinh
Tế bào gốc và tế bào tiền thân thần kinh cho thấy tiềm năng lớn trong điều trị các rối loạn thần kinh. Tế bào gốc dưới các điều kiện kiểm sốt có thể là nguồn tế bào cho liệu pháp tế bào điều trị các bệnh thần kinh. Có hai cách cách tiếp cận của điều trị bằng tế bào gốc là ghép các tế bào gốc hay tế bào thần kinh và kích hoạt tế bào nội sinh tăng sinh và biệt hóa. Một số bệnh rối loạn thần kinh có thể điều trị bằng liệu pháp tế bào gốc thần kinh.
Bệnh Parkinson khởi phát từ sự chết các tế bào thần kinh trong vùng chất đen của não, bắt đầu với tình trạng run nhẹ chân, tay, khó duy chuyển. Những neuron này truyền thông tin nhờ các axon dài với một vùng khác gọi là thể vân, chứa các vùng phụ nhân đuôi và nhân vỏ hến. Những neuron này từ vùng chất đen của não đến thể vân nhằm giải phóng một chất dẫn truyền thần kinh là dopamine vào neuron mục tiêu trong thể vân. Vai trò chính của dopamine là điều hịa các dây thần kinh kiểm soát sự vận động của cơ thể. Khi các tế bào này chết, dopamine tiết ra ít hơn dẫn đến sự di chuyển khó hơn. Chưa có phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân Parkinson, chiến lược điều trị chủ yếu dựa trên triệu chứng và gia tăng lượng dopamine trong đường truyền nigrostriatal. Neuron tiết dopamine từ tế bào
ES có thể được dùng để thay thế tế bào bị mất. Mặc dù điều trị trên mơ hình động vật có hiệu quả nhưng các thử nghiệm trên người sử dụng mơ từ thai có thể gây ra tác dụng phụ. Cần nghiên cứu nhiều hơn nữa để tiến tới điều trị ở người (Mattis và ctv, 2010).
Đối với bệnh Huntington, sự mất neuron kiềm hãm sự tiết GABA trong vỏ não dẫn tới sự mất kiểm soát vận động ở bệnh nhân Huntington. Trong quá trình tiến triển bệnh, các vùng khác nhau của não thối hóa và bệnh nhân chịu những ảnh hưởng về nhận thức trầm trọng. Liệu pháp thay thế hoặc bảo vệ neuron tiết GABA sử dụng tế bào từ NSC có thể làm chậm q trình bệnh, nhưng những vị trí thối hóa tăng lên nhanh chóng nên rất khó để xác định. Chuyển NSC tới các vị trí ở thể vân và vỏ não là hướng tiếp cận khả thi (Mattis và ctv, 2010).
SC phục hồi vị trí tổn thương, cung cấp cơ chất cho sự phát triển của axon trong tổn thương tủy sống. Một qui trình được cơng nhận bởi Cục quản lý thực phẩm và thuốc của Hoa Kỳ (Food and Drµg Administration _ FDA) sử dụng NSC
từ tế bào ES để tạo ra oligodendrocyte mới trong tủy sống bị tổn thương. Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng tế bào tiền thân hay tế bào gốc bất tử vẫn còn ở giai đoạn đầu.
NSC và tế bào gốc bất tử có thể di chuyển qua CNS và phục hồi vị trí thiếu máu cục bộ trong điều trị đột quỵ.
Sự thối hóa oligodendrocyte dẫn tới axon bị mất màng myelin và gây ra nhiều triệu chứng về thần kinh một cách từ từ đối với bệnh xơ cứng rải rác (Multiple sclerosis_MS). MS là một chứng rối loạn não bộ và tủy sống với chức năng thần kinh bị giảm sút kết hợp với việc hình thành sẹo trên lớp phủ ngoài của các tế bào thần kinh dẫn đến việc làm chậm hoặc tắc đường truyền xung nhịp thần kinh ở vùng đó. Tế bào thần kinh ít nhánh có đặc tính tốt hơn dịng tế bào thần kinh, tế bào tiền thân ít nhánh biệt hóa. Vấn đề chính trong liệu pháp chữa trị là cách kích hoạt sự di chuyển của các tế bào này tới các vị trí khác nhau nơi mất myelin (Temple, 2001).
" Xây dựng mơ hình sàng lọc thuốc
Việc sử dụng SC như là mơ hình phát triển thuốc và đánh giá độc tính đã được nghiên cứu trên thế giới. NSC được ứng dụng trong sàng lọc các sản phẩm hóa học và thiên nhiên cảm ứng sự biệt hóa của tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm. Kỹ thuật sàng lọc độc tính giúp các nhà nghiên cứu xác định các phân tử nhỏ có vai trị thúc đẩy sự phát sinh thần kinh, tìm ra các loại thuốc mới chữa trị các bệnh rối loạn thần kinh ở người. Đây là hướng nghiên cứu tiềm năng trong điều trị các bệnh về thối hóa thần kinh bằng thuốc.
1.2.4. Ni cấy tế bào gốc thần kinh
Tế bào có thể được nuôi cấy ở dạng khối cầu (neurosphere) ở dạng huyền phù và nuôi cấy lớp đơn. Tế bào được duy trì trạng thái khơng biệt hóa bằng cách dùng nhiều mitogen khác nhau (thường dùng yếu tố sinh trưởng biểu mô (epithelial growth factor_EGF) hay yếu tố phát triển nguyên bào sợi (basis fibroblast growth factor_bFGF)) và được tăng sinh bằng cách phân tách cụm tế bào sơ cấp thành cụm tế bào thứ cấp.
NSC có thể ni cấy trong điều kiện huyết thanh và khơng có huyết thanh, dưới dạng lớp đơn hay các quả cầu neurosphere. Tế bào bám dính vào bề mặt dễ dàng biệt hóa nếu khơng có các mitogen. Tế bào dễ dàng biệt hóa trong mơi trường có huyết thanh và khơng có mitogen. Để tế bào bám tốt, bề mặt dụng cụ nuôi cần phủ các protein ngoại bào cần thiết như poly–L–lysin, fibronectin, polyornithine, thylene–co–vinyl alcohol. Các NSC phát triển ở nồng độ đường cao, cần bổ sung một số chất cần thiết cho chuyển hóa như putrescin, progesterone, transferin, insulin, selenium. Nguyên tắc quan trọng nhất trong nuôi cấy NSC là hệ thống nuôi cấy chọn lọc không huyết thanh, trong đó hầu hết các tế bào CNS đã biệt hóa sơ cấp bị loại trừ sau khi cho vào môi trường trong khi các tế bào gốc chưa biệt hóa bước vào trạng thái tăng sinh. Mơi trường sử dụng là DMEM/F12, bổ sung với glucose, progesterone, putrescin, thành phần bổ sung B27, EGF, bFGF, ITSS (insulin – transferin – muối selenium) và heparin. Hỗn hợp của insulin, transferin, muối selenium, progesterone và putrescin còn gọi là yếu tố bổ sung N2. Hay nói cách khác, mơi trường cho ni cấy các NSC cơ bản bao gồm DMEM/F12, bổ sung B27,
N2 và EGF, FGF. Hiện nay, trên thị trường đã có mơi trường thương mại hóa với các thành phần và hàm lượng khác nhau (Phan Kim Ngọc, 2009).
" Nuôi cấy neurosphere
Phương pháp này lần đầu tiên được đề xuất vào năm 1992 bởi Weiss và Reynolds. Việc thực hiện tương tự với nuôi cấy lớp đơn, ngoại trừ không bao phủ đĩa với các protein chất nền cần thiết cho sự bám dính. Trong điều kiện nói trên, một số tế bào đã biệt hóa bám vào đáy bình ni và chết sau 2 – 3 ngày trong khi chỉ ít tế bào tiền thân chưa biệt hóa bắt đầu tăng sinh. Các NSC sẽ phát triển thành các tập đồn trơi lơ lửng gọi là neurosphere. Nếu chuyển các neurosphere này sang môi trường ni có huyết thanh, loại bỏ các mitogen thì chúng nhanh chóng biệt hóa thành các loại tế bào của hệ thần kinh.
Khoảng 10 – 50% tổng số tế bào được tạo ra giữ các đặc tính của tế bào gốc, phần tế bào còn lại tự biệt hóa. Neurosphere là hỗn hợp của tế bào gốc, tế bào tiền thân đang biệt hóa, neuron và tế bào thần kinh đệm (Fedorrof và Richardson, 2001). Phương pháp này có nhiều ưu điểm. Sự phân bố tế bào bên trong neurosphere cung cấp vi môi trường rất tốt cho tế bào tiền thân tồn tại trong điều kiện in vitro (Bez và ctv, 2003). Tuy nhiên, hệ thống tế bào này bất lợi trong việc duy trì tính gốc của tế bào. Tế bào tiền thân bên trong neurosphere có khuynh hướng biệt hóa, tăng mức độ đa dạng của tế bào. Sự tương tác giữa tế bào đang biệt hóa và tế bào tiền thân có thể kích thích tế bào gốc tạo nhân tố biệt hóa (Windhorst và Johansson, 2011). Kích thước neurosphere tăng lên chứa nhiều quần thể tế bào gốc không đồng nhất với tế bào tiền thân phân chia nhanh chóng ở vùng rìa (Reynolds và Reitze, 2005) làm cho cụm tế bào phân tách (Harish Babu và ctv, 2011).
Hình 1. 6. Quy trình chung ni cấy và tăng sinh NSC trong điều kiện không huyết thanh (Fedorrof và Richardson, 2001).
" Nuôi cấy lớp đơn
Nuôi cấy lớp đơn các NSC cũng có thể đạt được trong môi trường không huyết thanh như trên và phủ các dụng cụ ni với các kích thích cho sự bám dính (thường sử dụng là poly–L–lysin hoặc kết hợp với laminin, hay fibronectin hoặc polyorrnithine). Poly–L–lysine được ủ với dụng với bình Roux để chúng bám vào bề mặt đĩa trước. Thực chất, đây là phương pháp nhằm tạo ra vi môi trường giống với trong não.
Trong trạng thái bám dính, với sự hiện diện của các mitogen như EGF, FGF thì các NSC tăng sinh khơng biệt hóa. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng phương pháp này khó giữ được trạng thái khơng biệt hóa của tế bào khi ni cấy trong thời gian dài.
Trong nuôi cấy lớp đơn, tế bào tiếp xúc đồng nhất với nhân tố tăng trưởng trong mơi trường do đó tế bào tăng sinh theo cách phân chia đối xứng và ức chế sự biệt hóa tự phát (Conti và Cattaneo, 2005). Ưu điểm tiếp theo của ni cấy lớp đơn là tế bào có thể được nghiên cứu và thao tác trực tiếp, hình thái học của mỗi tế bào
được quan sát rõ và tế bào tiếp xúc hồn tồn với mơi trường nội bào được kiểm sốt.
" Ni cấy neurosphere cải tiến
Phương pháp này do Xue – Sheng Zeng và cộng tác viên đề xuất vào năm 2007. Nhóm nghiên cứu sử dụng một chất bao phủ dụng cụ nuôi là gel agarose nhằm ngăn chặn sự bám dính của neurrosphere vào dụng cụ ni.
Theo kết quả công bố, việc sử dụng hệ thống nuôi cấy khơng bám dính bằng gel agarose có thể ni cấy tế bào NSC ít nhất suốt 3 tháng liền mà chúng khơng bị biệt hóa và khơng có hiện tượng bám dính xảy ra. Agarose khơng làm ảnh hưởng đến sự tăng sinh và khả năng biệt hóa của NSC sau này (Zeng và ctv, 2007).
1.3. Một số nghiên cứu sử dụng dược liệu tự nhiên để kích thích tế bào gốc thần kinh gốc thần kinh
Các chiến lược nhằm bảo vệ tế bào thần kinh đang được nghiên cứu rộng rãi, một trong số đó là dược thảo Trung Quốc và dịch chiết dược thảo đã mang lại các lợi ích lâm sàng trong việc giảm triệu chứng bệnh Parkinson ở người. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh một lọat các dược thảo Trung Quốc và dịch chiết như polyphenol ở trà xanh (catechin) [14, 33, 59] panax ginseng [35, 37], ginsenoside [43], gingko biloba [9, 18, 29], Egb761, polygonum, tryptolide, flavonoid từ cánh hoa nerium indicum, dầu từ garnoderma lucidum [12, 71], huperzine, stepholidine có thể làm giảm sự thối hóa các tế bào thần kinh tiết dopamine và các triệu chứng gây ra do chất độc thần kinh MTTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) , 6-OHDA (6-hydroxydopamine) trong điều kiện in vitro và in vivo. Hơn nữa nhiều bằng chứng cho rằng dược liệu Trung Hoa và các dịch chiết dược thảo cịn có khả năng tăng cường sự sống và phát triển của tế bào thần kinh, hỗ trợ sự phục hồi tế bào thần kinh sau các tổn thương não. Các cơ chế liên quan đến khả năng bảo vệ thần kinh được cho là khả năng chống oxy hóa, dopamine transporter inhibitor, monoamine oxidase inhibitor, các scavenger bắt giữ gốc tự do, chelator của các ion kim loại có hại, điều hịa các gen giúp tế bào sống sót, hoạt động chống apoptosis, và ngay cả tăng tuần hoàn máu não.
Năm 2009, Faust và các cộng sự tại trường Y Stanford (Mỹ) đã chứng minh hiệu quả bảo vệ thần kinh của các hợp chất có khả năng chống oxy hóa và chống viêm trên mơ hình ruồi giấm (Drosophila) bị bệnh Parkinson. Mặc dù nguyên nhân gây bệnh Parkinson vẫn chưa rõ ràng, một số tác nhân gây bệnh đã được chứng minh như stress oxy hóa, ti thể mất chức năng, viêm. Ức chế gen DJ-1A, một đồng dạng của họ các gen gây bệnh Parkinson DJ-1, dẫn đến stress oxy hóa, ti thể lọan năng, thối hóa tế bào thần kinh làm cho mơ hình ruồi giấm DJ-1A trở thành mơ hình thí nghiệm lý tưởng cho bệnh Parkinson. Các nhà khoa học tiến hành khảo sát hiệu quả của celastrol thu từ dịch chiết thảo dược Trung Quốc, kháng sinh minocycline, coenzyme Q10 và NBQX (glutamate antagonist 2,3-dihydroxy-6- nitro-7-sulphamoylbenzo[f]-quinoxaline). Tất cả các hoạt chất này đều tấn cơng vào q trình sinh bệnh Parkinson. Tuy nhiên chỉ có celastrol và minocycline là bảo vệ tế bào thần kinh tiết dopamine, NBQX chống lại sự thối hóa tế bào tiết dopamine nhưng khơng giúp phục hồi mức dopamine, coenzyme Q10 [57] không phát huy tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh.
Năm 2007, Bureau G và cộng sự tiến hành đánh giá ảnh hưởng của 2 loại polyphenol tự nhiên resveratrol và quercetin đối với sự viêm thần kinh (neuroinflammation). Kết quả là mức mRNA của các gen gây viêm, interleukin-1- alpha, tumor-necrosis-factor-alpha giảm mạnh sau khi các tế bào thần kinh đệm được xử lý với resveratrol và quercetin (Canada). Tháng 2 năm 2010, các nhà khoa học Hàn Quốc đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của quercetin trên mơ hình chuột thiếu máu não. Mơ hình chuột C57BL/6 thiếu máu não được thực hiện bằng cách gây thiếu máu não cục bộ trong 20 phút. Sau đó quercetin (50mg/kg) được tiêm vào màng bụng trong 30 phút, và mỗi ngày một lần đến khi đánh giá hiệu quả bảo vệ tế bào não. Quercetin có tác dụng ức chế MNP-9 (matrix metalloproteinase)-một lọai protein trong việc gây thiếu máu não.
Năm 2008, All-trans retinoic acid (ATRA) đã được Zhong và cộng sự đã chứng minh hiệu quả biệt hóa tế bào gốc thần kinh chuột rat thành tế bào thần kinh tốt nhất của ATRA là ở nồng độ 1,00 micromol/L. Tongxinluo có thể cảm ứng sự biệt hóa và tăng sinh của tế bào gốc thần kinh rat ở các liều khác nhau.
Từ lâu, tiêu đen được dùng để chữa chứng động kinh trong y học Trung Quốc cổ truyền, tuy nhiên nguyên lý tác dụng của nó vẫn chưa được nghiên cứu. Gần đây, Fu và cộng sự đã báo cáo hiệu quả ức chế sự dao động của nồng độ calcium nội bào ở mạng lưới thần kinh hippocampus của chuột cống cũng như các họat động synapse ngẫu nhiên của piperine-một hoạt chất ưu thế trong hạt tiêu. Ngoài ra, tiền xử lý tế bào với piperine có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khi bị cảm ứng apoptosis.
Việt Nam là một quốc gia có nguồn cây thuốc dồi dào và một truyền thống sử dụng dược liệu từ nguồn gốc tự nhiên từ lâu đời. Những năm gần đây, các hợp chất thiên nhiên quí như chiết xuất từ Sâm Ngọc linh, Nấm linh chi đỏ và rau đắng biển đã được các đơn vị khoa học trong nước tập trung nghiên cứu. Đây là những dược liệu truyền thống Việt nam đã được chứng minh có tác dụng hiệu quả trong điều trị các bệnh về suy nhược thần kinh. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hợp chất dược liệu này tập trung vào nghiên cứu phương pháp nhân giống, nuôi cấy invitro, các phương pháp chiết xuất hiệu quả, ... cũng như hoàn thành các nghiên cứu về đánh giá thành phần, khảo sát dược tính và độc tính của các hợp chất.