CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Kết quả nội dung 2 Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh
3.2.1. Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não chuột
Trong thời gian thực hiện đề tài, tổng số lượng mẫu nuôi cấy sơ cấp được thực hiện là 40 mẫu. Trong đó, vì những lý do khách quan nên chuột thai được sử dụng thu nhận tế bào gốc thần kinh không đúng ở giai đoạn 14 ngày tuổi như yêu cầu ban đầu. Tế bào sơ cấp thu nhận có thể tăng sinh và phát triển trong mơi trường ni cấy có tính chọn lọc cho tế bào gốc thần kinh. Tỷ lệ nuôi cấy thành công tế bào thu nhận từ mô não chuột là 100%. Toàn bộ các mẫu thực hiện đều hình thành các sphere chứa các tế bào gốc thần kinh ứng viên có thể sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Trong quy trình ni cấy các loại tế bào gốc nói chung và tế bào gốc thần kinh nói riêng thường khơng dùng huyết thanh vì các thành phần khơng xác định trong huyết thanh có khả năng gây biệt hóa cao, khó duy trì tính gốc trong thời gian dài. Vì vậy để tăng hiệu quả ni cấy, mơi trường nền H-DMEM/F12 có nồng độ glucose cao được bổ sung thêm các nhân tố tăng trưởng EGF, bFGF, B27, N2, heparin.
trong quần thể tế bào sơ cấp tồn tại rất nhiều tế bào hồng cầu. (a) Mũi tên xanh chỉ
các tế bào hồng cầu, và mũi tên trắng chỉ các tế bào gốc thần kinh có hình dạng trịn đều. (b) Mũi tên đỏ chỉ tế bào bắt đầu tăng sinh tạo thành cụm tế bào nhỏ, có kích thước tăng dần theo thời gian.
Hình 3. 8. Các sphere bám xuống bề mặt bình ni cấy sau một thời gian phát triển.
(a) Các tế bào vùng rìa bắt đầu bám xuống bề mặt bình ni cấy, (b) Sphere bám trải sau một tuần, (c) Các tế bào bắt đầu trải dài và biệt hóa, (d) Các tế bào có hình thái của các loại tế bào thần kinh.
Có nhiều loại tế bào tồn tại ở lần ni cấy sơ cấp, do vậy địi hỏi sử dụng mơi trường nuôi cấy để chọn lọc, tinh sạch và nuôi tăng sinh quần thể tế bào gốc thần kinh quan tâm. Các tế bào gốc thần kinh ứng viên thu nhận từ mô não chuột thai sau khi được phân tách thành tế bào đơn có dạng hình cầu, nhân sáng, đường kính tế bào khoảng 14-16 µm. Ngồi các tế bào đơn, trên bề mặt Roux nuôi cấy cịn có thể thấy một số cụm tế bào có kích thước nhỏ. Các tế bào và cụm tế bào này sẽ bắt đầu tăng sinh sau 24 giờ nuôi cấy và phát triển thành cụm tế bào lớn hơn. Sau 2-5 ngày các mảng lớn, trải rộng được hình thành do nhiều loại tế bào không đồng nhất về kiểu hình lại với nhau. Sau lần huyền phù cơ học và thay môi trường đầu tiên, các loại tế bào nhiễm chết dần do tính chọn lọc của mơi trường. Các mảng dần tách ra
và các phần nhỏ của mảng này nếu chứa những tế bào gốc thần kinh sẽ hình thành những cụm tế bào hình cầu, đặc có kích thước khoảng 50 µm. Sau 7-10 ngày ni cấy các cụm tế bào này tăng sinh và phát triển hình thành các neurosphere có cấu tạo các tế bào liên kết chặt chẽ, lăn trịn được và có kích thước từ 100-500 µm [6].
Trong q trình thực hiện những mẫu sơ cấp, các sphere có khuynh hướng bám dính vào bề mặt bình ni khi đạt kích thước từ 300-500µm. Các tế bào ở phần rìa ngồi của sphere bắt đầu bám dính xuống bề mặt bình Roux và biệt hóa thành các dạng tế bào thần kinh. Sự bám dính và biệt hóa này gây trở ngại cho việc tăng sinh và đảm bảo tính gốc ban đầu của quần thể tế bào thu nhận. Để khắc phục hiện tượng bám dính của sphere, bề mặt bình Roux ni cấy cần được tráng bằng gel agarose để giảm khả năng bám dính của các tế bào. Tuy nhiên, nếu nuôi cấy trong thời gian dài, các sphere khi đạt đến kích thước quá lớn vẫn sẽ bám xuống bề mặt gel do khối lượng quá lớn, do khuynh hướng phát triển bám dính của tế bào khi hình thành các protein bám dính và sự tích tụ hàm lượng cao các nhân tố kích thích biệt hóa trong mơi trường ni cấy.
Hình 3. 9. So sánh mẫu sơ cấp thu từ não chuột thai và chuột trưởng thành. (a) Các
tế bào thu từ não chuột thai tách riêng lẻ-20X, (b) Các tế bào đơn bị lẫn trong các lớp myelin dày đặc kết thành những mảng lớn trong mẫu sơ cấp của não trưởng thành-10X
Bàn luận
Các nhân tố tăng trưởng EGF, FGF có khuynh hướng kích thích hình thành hai quần thể tế bào thần kinh riêng biệt về không gian in vivo. Đồng thời, Tropepe cũng chứng minh được rằng từng nhân tố riêng biệt có khả năng kích thích q trình nguyên phân tăng sinh tế bào thần kinh trong nuôi cấy in vitro. Một kết quả khác
trong nghiên cứu trên là các nhân tố tăng trưởng EGF và FGF không làm mất đi khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa thành các dịng tế bào thần kinh sau khi nuôi cấy. [21]
Các thành phần bổ sung môi trường B27 được tối ưu cho các loại tế bào có nguồn gốc thần kinh như tế bào neuron từ thể vân thai chuột, vùng liềm đen, hồi răng cưa và tiểu não. Thành phần bổ sung B27 có tác dụng tăng cường khả năng sống sót của các tế bào có nguồn gốc thần kinh hơn 50% so với môi trường không bổ sung B27. Một thành phần bổ sung khác được sử dụng trong đề tài là N2. N2 với các thành phần chính là putrescine, progesterone, transferin, insulin có tác dụng duy trì và tăng sinh quần thể tế bào có nguồn gốc thần kinh trong mơi trường ni cấy không huyết thanh. Insulin là một hormon polypeptide thúc đẩy sự hấp thụ glucose, các acid amin, điều chỉnh q trình trao đổi chất và có thể có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của tế bào gốc thần kinh. Transferrin đóng vai trị là kênh vận chuyển sắt cho tế bào, được tìm thấy trong huyết thanh động vật có vú và selenium là yếu tố vi lượng quan trọng giúp tách các gốc oxy tự do, được sử dụng như là một chất chóng oxy hóa trong mơi trường ni cấy. [18]
Theo lý thuyết, có nhiều loại tế bào tồn tại ở lần nuôi cấy sơ cấp từ mẫu mô như các dạng tế bào tạo máu, hồng cầu, và các tế bào dạng stroma, nguyên bào sợi được xem là các tế bào nhiễm, trong đó sẽ phát triển một kiểu tế bào trội nhất là dòng tế bào quan tâm. Vì vậy, tế bào trong mẫu sơ cấp có lẫn nguyên bào sợi, hồng cầu và nhiều loại tế bào khác (được coi là tế bào nhiễm) là một vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mảnh mô sơ cấp. Các tế bào hồng cầu tồn tại trong huyền phù hoặc bám vào mảnh mơ và có cùng tốc độ lắng với tế bào nên không thể loại ra khi ly tâm. Các tế bào hồng cầu sẽ tự chết dần đi sau vài lần cấy chuyền do tế bào này khơng có khả năng tăng sinh. Nguyên bào sợi xuất hiện trong mẫu mơ có nguồn gốc từ lớp biểu mô da phần đầu của thai khi tách mô não. Do các nguyên bào sợi này bám trải trên bề mặt bình Roux nên sau 3-4 lần cấy chuyền và chọn lọc, các nguyên bào sợi sẽ dần được loại bỏ. Trong mơi trường có xuất hiện các giọt mỡ là do trong q trình xử lý mẫu mơ khơng loại bỏ hết mỡ nên tạo ra những giọt mỡ lơ lửng. Ngoài ra, nếu sử dụng chuột thai ở giai đoạn 16-20 ngày, trong mơi trường ni cấy cịn có lớp myelin của các sợi trục tế bào thần kinh đang dần biệt hóa trong não. Nhưng
qua 2-3 lần thay môi trường nuôi cấy mới, các giọt mỡ và lớp myelin sẽ được loại bỏ. Nuôi cấy tế bào sơ cấp địi hỏi sử dụng nhiều mơi trường nuôi cấy để chọn lọc, tinh sạch và nuôi tăng sinh quần thể tế bào gốc thần kinh quan tâm [58].
Tuổi thai có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành và phát triển của sphere. Các sphere phân lập từ thai chuột 14 ngày sẽ cho hiệu quả ni cấy tốt nhất. Vì ở giai đoạn này những receptor của nhân tố tăng trưởng trên màng tế bào biểu hiện nhiều nhất, do đó kích thích sự tăng trưởng mạnh nhất. Do đó, khi ni trong điều kiện có đầy đủ các nhân tố tăng trưởng thì NSC từ thai 14 ngày sẽ tăng sinh nhanh nhất và duy trì khả năng phân chia lâu nhất. Cịn đối với những phơi thai chuột khoảng 18 ngày đến gần sinh thì tế bào trong não thai đã có sự định hướng biệt hóa thành các tế bào có chức năng, do đó sự biểu hiện receptor nhân tố tăng trưởng cũng giảm, khi nuôi cấy chỉ có thể duy trì trong thời gian ngắn. Bên cạnh đó, thai chuột q nhỏ (phơi thai dưới 8.5 ngày tuổi) do khơng tách ra được hồn tồn phần não nên dễ bị nhiễm nguyên bào sợi, sự hình thành sphere có thể rõ ràng nhưng do mơi trường có nhiều nguyên bào sợi tiết ra nhiều nhân tố biệt hóa dẫn đến các sphere bám xuống nhanh hơn [62].
Quy trình ni cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai có nhiều ưu điểm so với ni cấy tế bào gốc thần kinh từ não chuột trưởng thành. Quá trình phân lập tế bào gốc thần kinh từ não trưởng thành gặp trở ngại khi thu nhận tế bào đơn vì ngồi quần thể tế bào gốc quan tâm hạn chế về số lượng còn các yếu tố khác làm ảnh hưởng quá trình ni cấy, như sự tồn tại các loại tế bào thần kinh đã biệt hóa neuron, astrocyte và tế bào thần kinh đệm, các lớp bao myelin dày, các phần màng não. Các thành phần này nếu khơng được loại bỏ trong q trình xử lý mẫu sơ cấp thì các tế bào gốc sẽ khơng tiếp xúc được với chất dinh dưỡng và khó phát triển thành sphere. Ngoài ra, thời gian và hiệu quả hình thành sphere từ não trưởng thành cũng kém hơn so với sphere từ não thai.
3.2.1.1. Kết quả cấy chuyền các neurosphere:
Các kích thước sphere lớn (>500µm) cần thực hiện cấy chuyền để tạo thêm không gian phát triển cho tế bào và sự hình thành các sphere thứ cấp mới. Trong quá trình cấy chuyền, các sphere kích thước lớn sẽ bị tách thành các sphere kích
thước nhỏ hơn do lực cơ học. Khi cấy chuyền sang bình Roux mới, các loại tế bào nhiễm phát triển bám dính sẽ bị loại bỏ khỏi bình ni cấy.
Ngồi hiện tượng tế bào bám xuống bề mặt bình Roux và biệt hóa, các sphere sẽ hình thành các sphere thứ cấp khi các sphere này phát triển q lớn về kích thước (>500 µm).
Hình 3. 10. Sự hình thành sphere thứ cấp. (a)(b) Sphere bắt đầu phân tách thành hai
sphere nhỏ hơn, (c)Phần thắt eo hiện rõ giữa hai sphere-mũi tên xanh, (d)Các sphere tách rời nhau hình thành hai sphere mới-mũi tên cam.
Sau cấy chuyền đầu tiên, bình ni tế bào được thay môi trường đều đặn mỗi 3 ngày và cấy chuyền khi mật độ sphere tăng lên nhiều. Đến lần cấy chuyền tăng sinh thứ 5, các tế bào giống tế bào gốc thần kinh đồng nhất hơn về hình dạng, các sphere trịn và chặt chẽ hơn và vẫn tiếp tục phát triển về kích thước. Điều này chứng tỏ rằng qua mỗi lần cấy chuyền những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ chiếm ưu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ dần chết đi. Quần thể tế bào gốc thần kinh ứng viên có độ đồng nhất cao hơn sau mỗi lần cấy chuyền.
Bàn luận
Ở những sphere có đường kính lớn, những tế bào bên trong nhân của neurophere sẽ chết do không tiếp xúc được với mơi trường dinh dưỡng bên ngồi. Mặt khác, với kích thước và khối lượng lớn, các sphere có khuynh hướng bám xuống bề mặt bình ni cấy và các tế bào ở phần lớp ngoài sẽ dần bám dính và biệt
hóa thành các dạng tế bào thần kinh. Khi cấy chuyền, tế bào sẽ được cung cấp không gian mới và môi trường mới để phát triển và tăng sinh. Trong q trình cấy chuyền, các sphere kích thước lớn sẽ bị tách thành các sphere kích thước nhỏ hơn do lực cơ học. Các sphere nhỏ này sẽ có ít nguy cơ bám dính và biệt hóa hơn.
Khi các tế bào gốc thần kinh trong sphere phân chia, các loại tế bào ở các giai đoạn khác nhau sẽ phân chia với tốc độ không đồng đều gây ra sự không đồng nhất về loại tế bào trong sphere, đồng thời sự chết đi của các tế bào vùng nhân sphere do thiếu chất dinh dưỡng và các nguồn sống cần thiết cũng là nguyên nhân gây sự phân chia của các sphere lớn. Khi số lượng tế bào vượt quá giới hạn thì sphere sẽ tự động tách thành các sphere thứ cấp. Tùy theo kích thước và hình dạng của sphere sơ cấp mà có thể tạo thành hai hoặc ba sphere thứ cấp và các sphere thứ cấp thường có có kích thước khác nhau. Qua mỗi lần cấy chuyền những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ chiếm ưu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ dần chết đi. Quần thể tế bào gốc thần kinh ứng viên có độ đồng nhất cao hơn sau mỗi lần cấy chuyền. Kết quả này thể hiện rõ qua sự đồng đều về màu sắc, hình dạng của sphere.
Do sự hạn chế về khả năng phân chia tăng sinh của bản thân tế bào gốc thần kinh nên thời gian nuôi cấy và tăng sinh quần thể tế bào này không kéo dài lâu. Sau khoảng lần cấy chuyền thứ 9-10, các sphere trong bình ni mất dần độ nén chặt, các tế bào vùng rìa bắt đầu tách ra khỏi sphere, sau đó là các tế bào lớp bên trong cũng rã dần ra. Hình dạng sphere khơng cịn là hình cầu trịn mà dần dần rã thành từng mảng tế mỏng và rời rạc. Tuy nhiên, vẫn có một số sphere tách ra từ mảng tế bào tiếp tục tăng sinh và phát triển thành sphere mới. Điều này có thể giải thích do sự phân chia diễn ra không đồng đều giữa các tế bào nằm ở các vùng khác nhau của sphere, các tế vào vùng ngoài do phân chia nhiều hơn nên mất dần tính gốc và sẽ chết dần hoặc biệt hóa sau một khoảng thời gian ni cấy.
Các neurphere thu nhận được có khả năng tăng sinh và hình thành neurosphere mới khi cấy chuyền. Đây là một bằng chứng chứng minh khả năng tự làm mới của các tế bào ứng viên.
3.2.1.2. Kết quả đánh giá khả năng tự làm mới
Sau 5 lần cấy chuyền tăng sinh, quần thể tế bào lúc này đã được tinh sạch và loại bỏ các loại tế bào nhiễm chỉ còn lại các tế bào gốc thần kinh và tế bào tiền thân thần kinh. Khả năng tăng sinh và tái tạo sphere của các tế bào này nhanh hơn so với các mẫu sơ cấp. Sau 5-7 ngày, đường kính các sphere mới đạt khoảng 100-200 µm. Và sau 2-3 lần cấy chuyền tiếp theo, các sphere có kích thước từ 300-500 µm.
Q trình hình thành sphere xảy ra tương tự như quá trình hình thành các sphere từ mẫu sơ cấp nhưng khơng có sự hình thành các mảng tế bào khơng đồng nhất do các tế bào nhiễm đã bị loại bỏ qua các lần cấy chuyền.
Hình 3. 11. Quá trình hình thành các neurosphere.(a) Các tế bào trong môi trường
nuôi cấy bám thành từng cụm tế bào, (b) (c) Các cụm tế bào tăng sinh và phát triển kích thước, (d) Các sphere có dạng hình cầu sau 7-10 ngày ni cấy sơ cấp , (e) Các sphere có hình dạng trịn đều, lăn được và có độ nén chặt cao sau lần cấy chuyền thứ 1, (f) Sphere có hình dạng đều đẹp sau lần cấy chuyền thứ 4.
Bàn luận
Việc đánh giá khả năng tự làm mới phụ thuộc nhiều vào quá trình xử lý tạo huyền phù tế bào đơn. Enzyme trypsin phân tách tế bào được sử dụng là một loại enzyme mạnh, nếu để ủ tế bào trong trypsin quá lâu có thể ảnh hưởng đến khả năng hình thành sphere của các tế bào sau này. Do đó, phương pháp tách cơ học được sử dụng trước khi sử dụng enzyme có thể giảm thời gian ủ tế bào với trypsin và tăng
khả năng bám dính của tế bào hình thành sphere. Một số quy trình khác ưu tiên sử