2.1..6 Phương pháp sắc kí lớp mỏng
2.5.4. Phương pháp đánh giá hóa mơ miễn dịch [1, 4, 25, 26]
Phương pháp thu nhận mẫu:
Nguyên tắc: Quá trình chuẩn bị mô đảm bảo sự nguyên vẹn của cấu trúc mơ, tế bào
và tính kháng ngun (antigenicity) của đối tượng quan tâm. Mẫu mô cần được thu nhận trong tình trạng khơng nhiễm máu để tránh trường hợp kháng thể bắt vào kháng nguyên trong máu. Đối với động vật thí nghiệm, phương pháp truyền dịch tràn (perfusion) có thể được sử dụng để rửa sạch máu ra khỏi cơ thể. Sau đó, mơ
cần được cố định lại (fixation) bởi vì các protein hịa tan có thể che lấp các kháng nguyên trong quá trình bảo quản mơ sau đó. Dung dịch formaldehyde 4 % được pha trong PBSA thường được sử dụng để cố định mơ, vì formaldehyde có thể liên kết chéo các protein thơng qua các cầu nối cộng hóa trị và giữ cho cấu trúc của tế bào, mô bị phân hủy ở mức tối thiểu.
Quy trình:
- Chuột được gây mê sâu bằng hỗn hợp ketamine và xylazine. Sau 10 phút, kiểm tra phản xạ bằng cách kẹp nhẹ chi sau. Nếu chuột khơng cịn phản xạ thì có thể tiến hành bước tiếp theo
- Mở lồng ngực chuột bằng kéo. Nhẹ nhàng cắt bỏ các mô liên kết xung quanh tim, dùng mũi kéo tạo 1 lỗ ở ngay bên dưới tâm thất trái. Tương tự tạo 1 lỗ ngay bên trên tâm nhĩ phải
- Truyền khoảng 200 ml dung dịch PBSA thông qua lỗ ở tâm thất. PBSA sẽ đẩy máu đi hết hệ tuần hoàn và đi ra ngoài qua tâm nhĩ trái. Từ lúc bắt đầu truyền dịch, màu đỏ ở phổi và gan do máu tạo ra sẽ nhạt dần.
- Khi dung dịch chảy ra từ cơ thể chuột trở nên trong suốt, truyền tiếp dung dịch paraformaldehyde 4 %. Truyền dịch trong vòng 10 phút, cơ thể chuột sẽ cứng lại do tác dụng của paraformaldehyde, có thể kiểm tra bằng cách sờ vào các chi của chuột.
- Sau khi ngưng truyền dịch, để yên cơ thể chuột trong vòng 30 phút để paraformaldehyde có thể ngấm sâu vào tất cả các mơ. Sau đó, cắt đầu chuột bằng kéo và tách lấy não.
- Ngâm não chuột vào dung dịch sucrose 30 % và để ở 4 oC trong vịng 24 – 48h đến khi não chìm hẳn xuống đáy dụng cụ chứa. Lúc này mẫu não sẵn sàng để cắt lát mơ lạnh.
Hình 2. 5. Các bước phẫu thuật để thực hiện phương pháp truyền dịch tràn. Thực hiện theo thứ tự a-b-c-d-e
Phương pháp nhuộm kháng thể:
Nguyên tắc: Phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) khai thác kiến thức về giải phẫu học, miễn dịch và các phản ứng sinh hóa để phân biệt một cấu trúc mô cụ thể dựa vào tương tác giữa kháng thể được gắn một chất chỉ thị và kháng ngun ở mơ đó. Chất chỉ thị có thể là cơ chất hiện màu hoặc phát huỳnh quang. Người ta có thể sử dụng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch trực tiếp, chỉ sử dụng một loại kháng thể đánh dấu hoặc sử dụng thêm một kháng thể thứ cấp bắt vào vùng Fc của kháng thể sơ cấp và phát tín hiệu. Phương pháp sử dụng hai loại kháng thể cho phép khuếch đại tín hiệu vì rất nhiều kháng thể thứ cấp được gắn mẫu dị có thể bám vào kháng thể sơ cấp, đồng thời có một lý do kinh tế cho phương pháp này là kháng thể sơ cấp được gắn mẫu dò chỉ có thể sử dụng được cho duy nhất đối tượng mà nó được thiết kế. Nhìn chung, tồn bộ quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch có thể được chia ra thành 2 bước : chuẩn bị mô và nhuộm mơ.
Mẫu mơ sau khi được cố định có thể được cắt lát để quan sát cấu trúc quan tâm. Lát cắt mơ sau đó được xử lý để khóa (blocking) các vị trí khơng đặc hiệu để hạn chế sự nhiễu nền sinh ra do kháng thể bắt vào các vị trí khơng mong muốn. Đối với phương pháp gián tiếp, người ta thường sử dụng huyết thanh có chung lồi sản xuất với kháng thể thứ cấp để giảm tối thiểu sự nhiễu nền. Sau cùng, tùy vào trường hợp
kháng nguyên được biểu hiện bên ngoài hay bên trong tế bào mà mẫu mô cần được xử lý đục lỗ màng tế bào (permeabilization) hay không, thông thường một chất tẩy như Triton X-100 sẽ được sử dụng cho mục đích trên. Mẫu mô sau khi chuẩn bị xong sẽ được ủ lần lượt với các loại kháng thể đã chuẩn bị trước.
Alexa Fluor® 488 do cơng ty Life Technologies cung cấp là một chất nhuộm phát huỳnh quang màu xanh sáng dưới sự kích thích của laser có bước sóng 488 nm. Huỳnh quang phát ra có thể được quan sát dưới kính lọc FITC. Alexa Fluor® 488 được dung hợp với kháng thể thứ cấp Anti-Rabit sản xuất từ dê bắt vùng Fc trên kháng thể sơ cấp được sản xuất trên thỏ.
Sau khi ủ với kháng thể thứ cấp, bước cuối cùng là nhuộm chồng (counter- staining) lát mô với một chất nhuộm khác để tạo ra một sự tương phản để làm rõ cấu trúc quan tâm. Chất nhuộm này cũng có thể là tín hiệu màu có thể quan sát trên kính hiển vi quang học thơng thường, hoặc là phát huỳnh quang.
Sau đây là quy trình thu nhận lát cắt mơ não chuột và nhuộm hóa mơ miễn dịch để quan sát tế bào tiết dopamine trong vùng SNpc. Lát cắt được thu nhận theo sự tham khảo atlas não chuột của Allen Brain Atlas
Quy trình:
- Mơ não được cắt lát lạnh ở -25 oC
- Lát mô được rửa với TBST 2 lần, mỗi lần 2 phút
- Lát cắt mô được cố định và làm khô trên lame với acetone -20 oC trong vòng 5 phút
- Đục lỗ màng tế bào trên lát mô với 200 µl dung dịch Triton X-100 0.25 % trong 30 phút
- Rửa lát mô với TBST 2 lần, mỗi lần 2 phút
- Ủ lát mô với 200µl Blocking Buffer Serum trong 30 phút
- Hút bỏ Blocking Buffer Serum, lau sạch mép ngoài của lame. Ủ lame với kháng thể sơ cấp Anti-mouse tyrosine hydroxylase sản xuất từ thỏ pha loãng 1:100 ở 4 oC trong 24h.
- Sau khi ủ, rửa sạch kháng thể không bám bằng hỗn hợp Triton X-100 0.25 % và BSA 1 % trong vòng 5 phút
- Ủ lát mô với kháng thể thứ cấp Anti-rabbit Alexa Fluor® 488 sản xuất từ dê pha lỗng 1:80 ở 4 oC trong 24h
- Rửa sạch kháng thể không bám bằng 10ml dung dịch HBSS 5 lần
- Nhuộm nhân tế bào bằng Hoechst 33258. Cho lên bề mặt lát mơ khoảng 10 µl dung dịch phủ, đậy lát mô bằng lamelle
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng kích thích của FITC và DAPI. Chụp hình vùng SNpc với kính lọc tương ứng ở độ phóng đại 100x
Đánh giá kết quả:
Ảnh chụp vùng quan tâm được xử lý bằng phần mềm ImageJ 1.49v. Khoảng 6-8 lát cắt được thu nhận cho mỗi não. Số lượng tế bào dương tính với tyrosine hydroxylase và tổng số lượng tế bào ở vùng quan tâm của tất cả các lát cắt được đếm và tính ra tỉ lệ neuron tiết dopamine trên tổng số neuron quan sát.
Phương pháp nhuộm Hoechst
Nguyên tắc: Hoechst 33258 là một chất nhuộm huỳnh quang bám vào vùng giàu A-
T trên DNA mạch đôi trong nhân tế bào và phát huỳnh quang xanh dương ở bước sóng 460 – 490 nm khi được kích thích bởi tia UV. Quy trình thơng thường cho nhuộm Hoechst bao gồm các bước sau đây
Quy trình:
- Rửa lát mơ 2 lần với dung dịch đệm HBSS
- Cho vào mỗi lát mơ khoảng 200 µl dung dịch Hoechst 33258 0.5 µg/ml - Ủ lát mô ở 37 oC trong 30 phút
- Rửa lát mô 2 lần với dung dịch đệm HBSS
- Phủ bề mặt lát mô với dung dịch phủ thích hợp và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang
Đánh giá kết quả: Nhân tế bào bắt màu Hoechst xanh dương có thể được quan sát
dưới kính lọc DAPI. Việc đánh giá kết quả được tiến hành đồng thời với đánh giá nhuộm kháng thể.