Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 điều tra ựánh giá mức ựộ phổ biến và tác hại của bệnh HXVK hại một số
3.2.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith trên môi trường nhân tạo
solanacearum Smith trên môi trường nhân tạo
đặc ựiểm sinh trưởng của vi khuẩn trên các môi trường là chỉ tiêu quan trọng ựể nhận biết vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum. Ngoài ra nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt ựộ ựến khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường SPA nhằm xác ựịnh pH và nhiệt ựộ thắch hợp cho việc nhân nuôi sinh khối vi khuẩn, phục vụ nghiên cứu sinh học loài vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum Smith.
* Ảnh hưởng của môi trường ựến sự phát triển của các dòng vi khuẩn
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên hai môi trường thông dụng ựể giám ựịnh, nhân nuôi vi khuẩn: TZC và SPẠ Mỗi loại môi trường cấy 3 hộp, mỗi hộp cấy 3 ựiểm. đặt thắ nghiệm trong tủ ựịnh ôn với ựiều kiện nhiệt ựộ 30- 32oC, theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc và tiến hành ựo ựường kắnh khuẩn lạc vi khuẩn sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấỵ Kết quả thu ựược thể hiện ở bảng 3.8 và biểu ựồ 3.1.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng ựến sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập từ một số cây ký chủ
đường kắnh khuẩn lạc (mm) sau nuôi cấy (giờ)
24 48 72
Dòng vi
khuẩn SPA TZC SPA TZC SPA TZC
CC1 1.78ổ0.50 1.67ổ0.51 4.78ổ0.51 4.56ổ0.56 6.89ổ0.46 6.56ổ0.55 CP 1.56ổ0.54 1.44ổ0.55 4.67ổ0.54 4.44ổ0.55 6.78ổ0.51 6.44ổ0.55 L1 1.89ổ0.46 1.78ổ0.49 5.00ổ0.42 4.78ổ0.51 7.00ổ0.56 6.67ổ0.54 KT1 1.67ổ0.54 1.56ổ0.55 4.89ổ0.46 4.67ổ0.54 6.89ổ0.49 6.56ổ0.45
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng ựến sự phát triển của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập ựược cho thấy, các dòng vi khuẩn phân lập trên các cây cà chua, cà pháo, lạc, khoai tây ựều phát triển thuận lợi trên 2 môi trường SPA và TZC. Trên môi trường SPA, khuẩn lạc tròn, nhẵn bóng, lồi lên trên bề mặt môi trường. Trên môi trường TZC, khuẩn lạc tròn, hoặc có hình dạng không ựều, nhày, rìa có màu trắng trong, ở giữa có phớt màu hồng nhạt.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
SPA TZC SPA TZC SPA TZC
24 48 72 Môi trường đường kắnh khuẩn lạc (mm) CC1 CP L1 KT1
Biểu ựồ 3.1: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng ựến sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập từ một số cây ký chủ
Ảnh 3.11: Nhuộm Gram vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith bằng dung dịch KOH 3%
Trong các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum phân lập từ những cây ký chủ, chúng tôi nhận thấy các dòng vi khuẩn phân lập trên cây cà chua, lạc, khoai tây phát triển tốt và mạnh hơn so với dòng vi khuẩn phân lập từ cây cà pháo trên cả 2 môi trường. Sau 48 giờ nuôi cấy, dòng vi khuẩn phân lập từ cây cà chua ựược 4.78mm trên môi trường SPA, 4.56 mm trên môi trường TZC; dòng vi khuẩn phân lập từ cây lạc là 5.00mm trên môi trường SPA, 4.78mm trên môi trường TZC; dòng vi khuẩn phân lập từ cây khoai tây ựược 4.89mm trên môi trường SPA, 4.67mm trên môi trường TZC; dòng vi khuẩn phân lập trên cà pháo ựược 4.67mm trên môi trường SPA, 4.44mm trên môi trường TZC. Sự phát triển của các khuẩn lạc trên môi trường là khác nhau ựược quyết ựịnh bởi hệ men của vi khuẩn. Trên môi trường mà có các hợp chất dễ phân giải thì vi khuẩn phát triển tốt hơn. Vì vậy môi trường TZC thường ựược sử dụng ựể nhận biết vi khuẩn héo xanh, còn môi trường SPA dùng ựể nhân nuôi sinh khối vi khuẩn. Qua kết qủa theo dõi sự phát triển của vi khuẩn trên hai môi trường SPA và TZC sau 24, 48, 72 giờ nuôi cấy ở nhiệt ựô 30- 32oC chúng tôi nhận thấy ựường kắnh khuẩn lạc tăng mạnh từ 24 ựến 48 giờ ựầu nuôi cấy sau ựó tốc ựộ phát triển của khuẩn lạc chậm lạị Nguyên nhân là do từ 24 giờ ựến 48 giờ là giai ựoạn vi khuẩn phát triển theo cấp số nhân, lúc này tế bào vi khuẩn phân chia cực nhanh, nhưng từ 48 ựến 72giờ trở ựi, do các chất dinh dưỡng giảm và có sự tắch tụ của một số chất ức chế trong quá trình sử dụng chất dinh dưỡng vi khuẩn tạo ra trong môi trường nên tốc ựộ phát triển của vi khuẩn chậm dần lạị
Nhiệt ựộ cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn ựến sự phân bố cũng như sự phát sinh, phát triển gây hại của bệnh héo xanh vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập.
* Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sự phát triển của các dòng vi khuẩn
Những nghiên cứu trong và ngoài nước của nhiều tác giả ựã khẳng ựịnh, nhiệt ựộ là một trong những yếu tố ảnh hưởng ựến sự phân bố của loài vi khuẩn gây bệnh héo xanh R. solanacearum. Nhiệt ựộ thắch hợp cho vi khuẩn phát triển trong khoảng từ 25 ựến 35oC, nhiệt ựộ tối thiểu là 10oC và tối ựa là 41oC; pH thắch hợp là
7.0- 7.2 (Kelman et al. 1994).
Bệnh thường gây hại nặng ở những vùng nhiệt ựới với nhiệt ựộ trên 25oC cùng với ẩm ựộ caọ Bệnh HXVK phân bố rộng khắp thế giới, ựặc biệt là ở những vùng nhiệt ựới với mức ựộ gây hại nghiêm trọng (Hayward ẠC., 1986). Bệnh HXVK là loại bệnh quan trọng và ựiển hình nhất ở vùng nhiệt ựới, cận nhiệt ựới và những vùng có khắ hậu ôn ựới trên thế giới (Bradbuty, 1986; Hayward, 1994; Proir et al, 1997).
Tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến khả năng phát triển của loài vi khuẩn
R. solanacearum Smith trên môi trường nuôi cấy nhân tạo nhằm rút ngắn thời gian nuôi cấy và giữ ựược ựộc tắnh của vi khuẩn khi lây nhiễm bệnh nhân tạọ Mặt khác ựây cũng là cơ sở cho việc lựa chọn thời vụ trồng thắch hợp cũng như dự tắnh, dự báo sự phát sinh của bệnh HXVK ngoài ựồng ruộng.
Chúng tôi ựã tiến hành nuôi cấy vi khuẩn R. solanacearum ở 4 ngưỡng nhiệt ựộ 22- 24oC, 26- 28oC, 30- 32oC, 34- 36oC trên môi trường SPA với pH= 7.0 Ở mỗi ngưỡng nhiệt ựộ cấy vi khẩn trên 3 hộp, mỗi hộp cấy 3 ựiểm. Tiến hành theo dõi sau 72 giờ nuôi cấy, kết quả thu ựược thể hiện ở bảng 3.9, biểu ựồ 3.2.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt ựộ ựến sự phát triển của các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên môi trường SPA
đường kắnh khuẩn lạc (mm) sau nuôi cấy 72 giờ Dòng vi khuẩn 22- 24o C 26- 28oC 30- 32oC 34- 36oC CC1 4.78 ổ 0.49 5.89 ổ 0.49 6.89 ổ 0.46 5.78 ổ 0.49 CP 4.67 ổ 0.52 5.78 ổ 0.51 6.67 ổ 0.51 5.56 ổ 0.52 L1 4.89 ổ 0.46 6.00 ổ 0.56 7.00 ổ 0.56 5.78 ổ 0.52 KT1 4.78 ổ 0.51 5.67 ổ 0.49 6.78 ổ 0.49 5.67 ổ 0.51
0 1 2 3 4 5 6 7 đường kắnh khuẩn lạc (mm)