Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng
2.3.2.1. Phương pháp chẩn ựoán, phân ly nuôi cấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Phương pháp chẩn ựoán nhanh bệnh HXVK: Lấy mẫu cây bệnh có triệu chứng ựiển hình, cắt ngang thân sát gốc dài 3- 5cm, ựặt trong cốc nước vô trùng sau 10 phút ựem ra quan sát thấy có dịch vi khuẩn màu trắng sữa tiết ra ở ựầu vết cắt và dịch ở trong cốc nước (Mc Carter S. M,1991).
+ Phân lập vi khuẩn: Dùng que cấy vi khuẩn ựã khử trùng trên ngọn lửa ựèn cồn, lấy một vòng dịch trên bề mặt cắt của thân cây bệnh cấy trên môi trường TZC (Kelman, A, 1954). Nuôi cấy trong ựiều kiện nhiệt ựộ 30- 32oC, theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 giờ, các khuẩn lạc riêng rẽ hình tròn, nhày, không ựều, rìa màu trắng ở giữa có phớt màu hông nhạt. Cấy truyền vi khuẩn trên môi trường SPA, theo dõi sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường: khuẩn lạc tròn, nhẵn bóng, có màu trắng kem, bề mặt ướt ựó là vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuần khiết.
2.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ựến khả năng phát triển của vi khuẩnRalstonia solanacearum
+ Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: Nuôi cấy vi khuẩn trên 2 môi trường nhân tạo là TZC, SPẠ Mỗi môi trường cấy 3 hộp, mỗi hộp cấy 3 ựiểm. đặt thắ
nghiệm trong tủ ựịnh ôn với nhiệt ựộ 30- 32oC.
+ Ảnh hưởng của pH môi trường: Thắ nghiệm ựược tiến hành trên môi trường SPA với ngưỡng từ 5,5- 8,5. Mỗi ngưỡng cấy 3 hộp, mỗi hộp cấy 3 ựiểm. đặt thắ nghiệm trong tủ ựịnh ôn với nhiệt ựộ 30- 32oC.
+ Ảnh hưởng của nhiệt ựộ: Thắ nghiệm ựược tiến hành trên môi trường SPA có pH= 7,0. Ở mỗi ựiều kiện nhiệt ựộ cấy vi khuẩn trên 3 hộp, mỗi hộp cấy 3 ựiểm. đặt thắ nghiệm trong các ựiều kiện nhiệt ựộ: 22- 24oC, 26- 28oC, 30- 32oC và 34- 36oC.
Chỉ tiêu: theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc (mm) vi khẩn ở các yếu tố thắ nghiệm sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấỵ
2.3.2.3. Nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái tế bào và khuẩn lạc của các isolate vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Nghiên cứu ựặc ựiểm hình thái khuẩn lạc: Cấy các isolate vi khuẩn trên 2 môi trường: TZC, SPA ựặt trong ựiều kiện nhiệt ựộ thắch hợp 30- 32oC.
Chỉ tiêu: quan sát, theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn, màu sắc bề mặt khuẩn lạc, tốc ựộ phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy (Kelman, A, 1997).
+ Phương pháp nghiên cứu hình thái tế bào của vi khuẩn Ralstonia solanacearum: Chúng tôi tiến hànhnhuộm và quan sát tế bào vi khuẩn theo phương pháp nghiên cứu của Nishizawa Kangen và Hucker (Schaad, N.W, 1998).
+ Nghiên cứu các ựặc tắnh sinh hoá của các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh Khả năng phân giải các hợp chất cacbon: 3 loại ựường : Maltose, Cellobiose, Lactose và 3 loại rượu mạch vòng : Mannitol, Sorbitol, Dulcitol.
điều chế các loại môi trường ựể khảo sát các phản ứng sinh hoá. Dựa theo tài liệu của Lelliott và cộng tác viên (1987) và Denny và Hayward (2005).
Các isolate vi khuẩn thuần, ựược cấy trên môi trường SPẠ Sau ựó, dùng que cấy lấy một vòng vi khuẩn cấy vào các ống nghiệm ựã chuẩn bị sẵn các nguồn cacbon. Mỗi phản ứng ựược nhắc lại 3 lần. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường lỏng và sự chuyển màu của môi trường của từng phản ứng sau 5 - 7 ngàỵ
2.3.2.4. Phương pháp thử gram vi khuẩn Ralstonia solanacerum bằng dung dịch KOH 3%
Thắ nghiệm tiến hành với các mẫu vi khuẩn héo xanh cà chua, cà pháo, cà bát, lạc và khoai tâỵ
Mỗi Isolate vi khuẩn phân lập ựược từ cây kắ chủ khác nhau, sau khi ựã phân lập và nuôi cấy trên môi trường SPA, mỗi mẫu phân lập chọn ra 1 ựĩa môi trường mới cấy chuyển ( 72 giờ trờ lại).
Chuẩn bị lam sạch và dung dịch KOH 3%, nhỏ 1 giọt nhỏ dung dịch KOH lên bề mặt lam ựã khử trùng, sau ựó dùng que cấy vi khuẩn, lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn từ ựĩa môi trường của các mẫu phân lập ựược. Mỗi mẫu phân lập lặp lại như thế. đợi 30 giây cho khuẩn lạc vi khuẩn tan ựều trong giọt KOH, dùng ựầu que cấy vi khuẩn khẽ kéo giọt dịch lên, nếu vi khuẩn gram âm thì sẽ có dạng nhầy và có thể kéo lên cao 2 Ờ 3 cm.
2.3.2.5. Nghiên cứu khả năng tồn tại của vi khuẩn R. solanacearum trong ựất trồng ở các chế ựộ luân canh cây trồng khác nhau
Lấy mẫu ựất ựại diện ở tầng ựất có ựộ sâu 0- 15 cm ở 3 công thức luân canh: Cà chua - Lạc - Cà chua; Lúa - Rau màu - Cà chua; Lúa - Lúa - Cà chuạ Sau ựó phân lập xác ựịnh sự tồn tại của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
Phương pháp tiến hành: Ở mỗi mẫu ựất cân 5g (ựất ựã ựược trộn ựều) cho vào 45 ml nước vô trùng, lắc cho tan ựều, ựược dung dịch ựất có ngưỡng pha loãng 1:10 (1). lấy 1 ml dung dịch (1) pha với 9 ml nước vô trùng ựược dung dịch ựất có ngưỡng pha loãng 1:100 (2). Tiến hành pha loãng tương tự, ựược dãy các dung dịch ựất có ngưỡng pha loãng 1:103; 1:104; 1:105.
Ở các ngưỡng pha loãng lấy 0,1 ml dung dịch ựất cấy vào mỗi hộp petri môi trường TZC trang ựều trên bề mặt hộp. Mỗi ngưỡng pha loãng nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 hộp. đặt môi trường nuôi cấy trong ựiều kiện nhiệt ựộ thắch hợp 30- 32oC.
Chỉ tiêu theo dõi: đếm số khuẩn lạc của vi khuẩn trên mỗi hộp, tắnh số khuẩn lạc trung bình/hộp, từ ựó tắnh mật ựộ tế bào vi khuẩn trung bình trên 1g ựất theo phương pháp của Kiraly, Z và CTV. (1983).
Trong ựó A: Mật ựộ tế bào vi khuẩn trên 1g ựất
x: Số khuẩn lạc trung bình/ hộp ở ngưỡng pha loãng b b: Ngưỡng pha loãng của dung dịch ựất
10: Hệ số pha loãng của dung dịch ựất