Phần 3 Vật liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Thực trạng bệnh viêm tử cung ở bò sữa tại huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội và huyện Vĩnh Tƣờng, tỉnh Vĩnh Phúc Hà Nội và huyện Vĩnh Tƣờng, tỉnh Vĩnh Phúc
- Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa tại huyện Ba Vì (Hà Nội) và huyện Vĩnh Tường (Vĩnh Phúc);
- Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung bò sữa ở các giai đoạn khác nhau; - Khảo sát tỷ lệ mắc các thể viêm tử cung ở bò sữa.
3.2.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng tới tỷ lệ viêm tử cung ở bò sữa
- Ảnh hưởng của lứa đẻ đối với viêm tử cung ở bò sữa;
- Ảnh hưởng của sản lượng sữa đối với tỉ lệ mắc bệnh viêm tử cung ở bị sữa;
- Ảnh hưởng của đẻ khó và sót nhau đối với viêm tử cung ở bị sữa.
3.2.3. Sự biến đổi một số chỉ tiêu lâm sàng, vi khuẩn học trong bệnh viêm tử cung ở bò sữa cung ở bò sữa
- Xác định sự thay đổi một số chỉ tiêu lâm sàng khi bò sữa bị viêm tử cung;
- Xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa;
- Xác định sự biến đổi về thành phần vi khuẩn hiếu khí có trong dịch viêm tử cung của bị sữa.
3.2.4. Tính mẫn cảm với kháng sinh của một số vi khuẩn hiếu khí đƣợc phân lập từ dịch tử cung bò sữa
- Xác định tính mẫn cảm của các vi khuẩn phân lập được từ dịch tử cung bò sữa với một số thuốc kháng sinh thơng dụng;
- Xác định tính mẫn cảm của tập đồn vi khuẩn có trong dịch viêm đường sinh dục bò sữa với một số thuốc kháng sinh và trị liệu.
3.2.5. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm có nguồn gốc thảo dƣợc phịng và trị bệnh viêm nội mạc tử cung ở bò sữa
- Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của một số loại thảo dược với
vi khuẩn Staphylococcus spp và Streptococcus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò.
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus spp. và
Streptococcus spp. invitro phân lập từ dịch viêm tử cung bò của 05 loại cao khô
dịch chiết (phytocide) thu được từ 05 loại dược liệu sử dụng dung môi ethanol 70% khi phối trộn với nhau.
- Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm có nguồn gốc thảo dược đến một số chỉ tiêu lâm sàng của bò.
+ Sự biến đổi thân nhiệt; + Sự biến đổi tần số hô hấp; + Sự biến đổi tần số mạch đập;
+ Sự biến đổi tần số nhu động dạ cỏ;
+ Theo dõi ảnh hưởng của chế phẩm có nguồn gốc thảo dược đến phản ứng co của tử cung bò.
- Nghiên cứu sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thảo dược phòng bệnh viêm tử cung cho bò:
+ Ảnh hưởng của chế phẩm có nguồn gốc thảo dược đến thời gian thải dịch sau khi đẻ của bò;
+ Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn trong dịch tử cung bò cái sau đẻ của chế phẩm có nguồn gốc thảo dược;
+ Ảnh hưởng của chế phẩm có nguồn gốc thảo dược đến tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung của bò sau khi đẻ.
- Nghiên cứu sử dụng các chế phẩm nguồn gốc thảo dược để điều trị bệnh viêm tử cung cho bò:
+ Đánh giá hiệu quả của chế phẩm có nguồn gốc thảo dược để điều trị bệnh viêm tử cung sau đẻ của bò;
+ Đánh giá khả năng sinh sản của bò sau khi điều trị khỏi bệnh viêm tử cung bằng chế phẩm có nguồn gốc thảo dược.
3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu thực trạng bệnh viêm tử cung ở bò sữa tại huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội và huyện Vĩnh Tƣờng, tỉnh Vĩnh Phúc
- Xác định tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung bằng phương pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp người chăn nuôi kết hợp với việc trực tiếp theo dõi, ghi chép tổng số 233 hộ chăn ni với 857 con bị được ni tại nơng hộ tại huyện Ba Vì (Hà Nội) và Vĩnh Tường (Vĩnh Phúc). Đàn bò nghiên cứu được theo dõi đầy đủ các thông tin: giai đoạn mắc bệnh viêm tử cung, tỷ lệ mắc các thể viên tử cung, lứa đẻ, sản lượng sữa, có tiền sử mắc bệnh đẻ khó, bệnh sát nhau hay khơng bị mắc các bệnh này.
Sử dụng phương pháp Whiteside test (Bhat et al., 2014) để kiểm tra mẫu
dịch lấy từ bò nghi bị viêm tử cung hay bị khơng bị viêm tử cung: lấy 1ml dịch tử cung cần kiểm tra vào ống nghiệm sạch, sau đó cho thêm 1ml dung dịch NaOH 5% vào ống nghiệm và đun sôi. Để ống nghiệm trong giá đựng cho tới khi dung dịch nguội và đánh giá kết quả như sau:
+ Nếu dung dịch khơng có màu thì được cho là dịch tử cung bình thường; + Nếu dung dịch có màu vàng thì dịch được cho là dịch viêm tử cung. - Xác định tỷ lệ mắc viêm tử cung theo công thức tiêu chuẩn:
Tổng số bò mắc VTC
Tỷ lệ bò bị VTC (%) = × 100 Tổng số bò được theo dõi
3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng tới tỷ lệ viêm tử cung ở bò sữa
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu thực trạng bệnh viêm tử cung ở bò sữa, phân chia đối tương bò sữa theo giai đoạn mắc bệnh viêm tử cung, tỷ lệ mắc các
thể viên tử cung, lứa đẻ, sản lượng sữa, có tiền sử mắc bệnh đẻ khó, có tiền sử mắc bệnh sát nhau hay không mắc các bệnh này để đánh giá tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung ở bò sữa theo giai đoạn và đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm tử cung ở bò sữa.
3.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu sự biến đổi một số chỉ tiêu lâm sàng, vi khuẩn học trong bệnh viêm tử cung ở bò sữa
- Xác định một số biến đổi chỉ tiêu lâm sàng bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa tại địa phương được xác định bằng các phương pháp khám lâm sàng như bắt mạch, đo thân nhiệt, nghe, quan sát, ghi chép các tiêu chí như: thân nhiệt, tần số mạch đập, tần số hô hấp, phản ứng co cơ tử cung, khả năng thu nhận thức ăn, nước uống, tình trạng chảy dịch viêm tử cung.
- Sử dụng phương pháp vi khuẩn học để xác định biến đổi một số chỉ tiêu vi khuẩn học trong bệnh viêm tử cung ở bò sữa: Sau khi được kiểm tra bằng phương pháp whiteside test, các mẫu dịch được kiểm định thành phần và số lượng vi khuẩn hiếu khí bằng cách ni cấy trên mơi trường thạch thường. Tổng số 50 mẫu bệnh phẩm dương tính và 50 mẫu bệnh phẩm âm tính với phương pháp whiteside test được tiến hành kiểm tra thành phần, số lượng vi khuẩn hiếu khí. Việc phân lập xác định vi khuẩn hiếu khí được thực hiện theo tiêu chuẩn phịng thí nghiệm ISO-17025 (Phịng thí nghiệm chỉ định Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn).
3.3.4. Phƣơng pháp xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của một số vi khuẩn hiếu khí đƣợc phân lập từ dịch tử cung bị sữa
Việc thử tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh được thực hiện bằng phương pháp kháng sinh đồ, kết quả đánh giá theo “Các tiêu chuẩn lâm sàng trong phịng thí nghiệm của Hội đồng Quốc gia Mỹ” (The United State National Committee for Clinical Laboratory Standards guidelines- NCCLS, 1997).
3.3.5. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm có nguồn gốc thảo dƣợc phịng và trị bệnh viêm nội mạc tử cung ở bị sữa
3.3.5.1. Quy trình tách chiết các loại thảo dược
Quy trình chung của các loại thảo dược (ở các bước khác nhau, sẽ có điều chỉnh phù hợp với từng loại dược liệu).
Hình 3.1. Quy trình tách chiết các loại thảo dƣợc
Nguồn: Nguyễn Văn Thanh và cs. (2016)
Trên cơ sở nghiên cứu, khảo sát 08 loại cây dược liệu, chọn lọc 05 loại dược liệu có tính kháng khuẩn cao với vi khuẩn gây viêm tử cung để sử dụng trong phòng, trị bệnh. Cụ thể 05 loại cây sau:
1. Cây Mò hoa trắng (Clerodendron fragrans Vent);
2. Cây Bồ công anh (Lactuca indica L.);
3. Cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.);
4. Thân lá cây Sài đất (Wedelia calendulaceae Less);
5. Lá cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var. pendula).
Theo Nguyễn Văn Thanh và cs. (2016), năm loại cây trên được thu hái theo quy trình sau:
Cao khô dược liệu (11) Làm ẩm dược liệu (4)
Ngâm trung gian (6)
Rút dịch chiết (7) Sấy khô (10) Loại tạp chất (8) Cô đặc (9) Dung môi (5) Dung môi (5) Dung môi (5) Bột dược liệu (3)
Dược liệu khô (1)
Nghiền thô, mịn (2) (2)
Bƣớc 1:
Thu hái lá lành lặn, bánh tẻ, không bị sâu, nhàu nát, thu hái vào những ngày khô ráo, khoảng từ 7 - 10 giờ sáng;
Lá tươi thu hái về được rửa nước sạch (2-3 lần), sau đó được phơi, sấy khơ (ở nhiệt độ khoảng 40oC) sau đó tiến hành bào chế.
Bƣớc 2 và 3: Nghiền thô và nghiền mịn
Năm loại dược liệu sau khi loại bỏ tạp chất xử lý sơ bộ ở bước 1 được tiến hành nghiền thơ sau đó đến nghiền nhỏ đáp ứng tiêu chuẩn như sau:
Dược liệu đã được làm khô tiến hành nghiền nhỏ dược liệu trong máy nghiền. Mẫu khô được nghiền thành bột mịn (<0,5mm). Bột dược liệu đựng trong túi nilong bảo quản trong bình hút ẩm.
Bƣớc 4: Làm ẩm dƣợc liệu
Mỗi lần tách chiết 1kg bột làm ẩm dược liệu bằng 1 lít dung mơi.
Bƣớc 5: Dung mơi sử dụng là ethanol 70%
Tác giả Nguyễn Văn Thanh và cs. (2016) đã nghiên cứu, thử nghiệm nhiều loại dung môi khác nhau và đưa ra kết quả sử dụng dung môi ethanol 70% để pha chế thảo dược phòng và điều trị bệnh viêm tử cung ở bò sữa.
Bƣớc 6: Ngâm trung gian
Tiến hành ngâm bột dược liệu trong vịng 72 giờ, bổ sung 7 lít dung mơi ethanol 70% (có lắc đảo).
Bƣớc 7: Rút dịch chiết
Bổ sung 01 lít dung mơi ethanol 70%. Sau 72 giờ, thu dịch chiết, lọc qua vải gạc để sơ bộ loại bỏ tạp chất, vắt khô bã để thu được triệt để dịch chiết.
Bƣớc 8: Loại bỏ hoàn toàn tạp chất
Chia nhỏ lượng dịch chiết thu được vào các ống facon, đưa vào máy ly tâm quay 3.000 vòng/phút trong 2 phút. Cặn sẽ lắng hết xuống đay thu phần dịch trong.
Bƣớc 9: Cô đặc
Dịch trong thu được đem hút chân không thu cao khô.
Bƣớc 10: Đông khô sản phẩm
Tiến hành đông khô sản phẩm thu được trong máy đông khô.
Bƣớc 11: Bảo quản sản phẩm
3.3.5.2. Nguyên tắc phối trộn các hoạt chất trong chế phẩm thảo dược
Theo quy định của chế độ phong kiến trước đây, nguyên tắc phối hợp các vị thuốc trong đông y được tuân thủ theo quy ước về vị trí ngơi thứ của chế độ phong kiến, đó là: Quân, Thần, Tá, Sứ. Vai trò cụ thể của các thành phần như sau:
+ Qn: Là vị thuốc có tác dụng chính trong phương, có cơng năng chính, giải quyết triệu chứng chính của bệnh. Vị quân thường mang tên bài thuốc. Vị qn khơng nhất định phải có liều lượng cao, đôi khi liều nhỏ nhưng đủ mạnh cũng đóng vai trị qn.
+ Thần: Một vị hay nhiều vị có tác dụng hỗ trợ vị Quân để giải quyết triệu
chứng chính, đồng thời vị Thần cũng có tác dụng giải quyết một khía cạnh nào đó của bệnh. Có thể có nhiều nhóm Thần, giải quyết nhiều khía cạnh khác nhau.
+ Tá: Một hay nhiều vị thuốc có tác dụng, giải quyết một triệu chứng nào đó của bệnh. Có thể có nhiều nhóm tá, mỗi nhóm giải quyết một triệu chứng của bệnh. Chính những vị tá đã làm phong phú thêm cho tác dụng của phương thuốc. Sự đa dạng của phương thuốc thường phụ thuộc vào nhóm tá.
+ Sứ: vị thuốc có tác dụng dẫn thuốc vào kinh, hoặc giải quyết một triệu chứng phụ của bệnh, cũng có khi mang tính chất hịa hỗn sự mãnh liệt của phương thuốc.
Việc phối trộn thuốc trong nhiều trường hợp là sự kết hợp giữa các thành phần quân, thần, tá, sứ.
Theo cách nói của người xưa, nguyên tắc phối trộn thảo dược phải có vị chính, vị phụ, vị chủ yếu, vị hỗ trợ. Tuy nhiên, một phối trộn thuốc có thể có đủ cả quân, thần, tá, sứ mà khơng nhất thiết phải có đủ 4 vị. Có khi chỉ độc vị nhưng cũng có thể làm nhiệm vụ của cả quân và sứ hoặc thần và tá.
3.3.5.3. Quy trình bào chế chế phẩm thảo dược dạng huyền phù để phòng và điều trị bệnh viêm nội mạc tử cung ở bò sữa
Để bào chế chế phẩm lỏng huyền phù phục vụ cho mục đích bơm vào tử cung, chúng tơi sử dụng dược chất là cao thảo dược nguyên chất sau khi làm đơng khơ hồn tồn, cịn dung mơi để phân tán dược chất này là một hỗn hợp tá dược lỏng và nhớt được tạo thành từ ethanol, glyceryl và nước cất.
Các bước bào chế được tiến hành như sau:
Hòa cao thảo dược vào ethanol 20% để tạo thành hỗn dịch chứa dược chất có nồng độ ban đầu là 1.000 mg/ml. Trước khi hòa tan vào dung mơi cuối có glycerin, chúng tơi tiến hành sơ bộ hòa cao thảo dược vào ethanol 20% đến nồng độ 1.000 mg/ml. Do cao thảo dược khơng tan được hồn tồn trong ethanol 20% nên vẫn có một lượng hạt không tan nhất định lơ lửng trong dung dịch. Chúng tôi sử dụng dạng hỗn dịch lỏng này làm nguyên liệu cho bào chế dạng huyền phù. Vì khi đó, do cao thảo dược đã được sơ bộ phân tán vào ethanol 20% thành các hạt nhỏ trước khi trộn tiếp với hỗn hợp nước và glyceryl, nên kích thước hạt dược chất trong huyền phù cuối cùng nhỏ hơn, huyền phù chậm bị lắng cặn hơn và sau khi lắng cặn cũng dễ dàng phân tán đều trở lại trong huyền phù.
Hình 3.2. Cao thảo dƣợc sau đơng khơ đƣợc phân tán trở lại dạng lỏng hòa vào ethanol 20% đến hỗn dịch chứa dƣợc chất có nồng độ ban đầu
là 1.000 mg/ml
Tiếp theo trộn hỗn dịch chứa cao thảo dược nồng độ 1.000 mg/ml vào dung môi gồm nước cất và glyceryl để tạo thành các huyền phù có nồng độ dược chất 100 mg/ml; 200 mg/ml và 300 mg/ml. Để tăng khả năng bám dính và tăng
thời gian lưu lại của thuốc trong niêm mạc tử cung, chúng tôi sử dụng hỗn hợp nước và glyceryl lỏng làm dung môi phân tán của huyền phù.
Cách bào chế hỗn hợp tá dược nhớt này là lấy 5 phần nước cất trộn với 5 phần glyceryl lỏng (cứ 1 lít nước cất trộn với 1 lít glyceryl lỏng), sau đó lắc trộn thật đều thành một hỗn hợp đồng nhất. Dung mơi này có độ nhớt cao hơn nước nên tăng được khả năng bám dính và thời gian lưu lại của thuốc trong tử cung sau khi bơm.
Công thức bào chế: Cho cao dược liệu đã phân tán nồng độ 300 mg/ml
vào trong ethanol 20% với lượng từng ít một vào 90ml Propylen glycol, vừa cho vừa trộn đều, sau đó thêm 400 ml nước và cuối cùng thêm glyceryl cho vừa đủ 1.000ml.
Kỹ thuật bào chế:
- Chuẩn bị dụng cụ bào chế, lọ đựng thành phẩm sạch, khô;
- Hút chính xác lượng nước cất và glyceryl lỏng theo công thức rồi trộn đều;
- Nhỏ từ từ cồn ethanol 20% vào bột dược chất cao thảo dược, vừa cho vừa khuấy đều để phân tán. Tiếp tục thêm dần dần cồn theo cách như vậy cho đến khi cao thảo dược được chuyển hoàn tồn thành các hạt nhỏ khơng nhìn thấy bằng mắt thường trong hỗn dịch thì dừng lại. Thêm tiếp cồn ethanol 20% để nồng độ cao trong hỗn dịch là 1.000 mg/ml. Hỗn dịch này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu trong bào chế huyền phù. Chú ý trước khi sử dụng hỗn dịch để bào chế dạng huyền phù ở bước tiếp theo cần phải lắc mạnh hỗn dịch đến khi độ phân tán là đồng nhất;
- Cho từ từ hỗn dịch chứa cao thảo dược trong ethanol 20% vào hỗn hợp dung môi gồm nước cất và glyceryl, vừa cho vừa khuấy đều đến khi thấy dược chất phân tán đều trong dung mơi thì dừng lại. Sau đó thêm dung môi cho đến vừa đủ lượng dung dịch cần bào chế theo tính tốn;
- Trộn kỹ hỗn hợp huyền phù cuối đến khi dung dịch hoàn toàn đồng nhất