4.6b Ảnh hưởng của sát nhau đối với bệnh viêm tử cung ở bò sữa
3.3. Huyền phù sử dụng công thức 3 tại nồng độ 300 mg/ml
Nguồn: Nguyễn Văn Thanh và cs. (2016)
3.3.5.4. Quy trình bào chế chế phẩm thảo dược dạng viên đặt để phòng và điều trị bệnh viêm nội mạc tử cung ở bò sữa
Thuốc đặt là dạng thuốc phân liều, có thể rắn ở nhiệt độ thường, khi đặt vào các hốc tự nhiên của cơ thể thì chảy lỏng hoặc hịa tan vào niêm dịch để giải phóng dược chất nhằm gây tác dụng tại chỗ hoặc toàn thân.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, với dạng thuốc viên chúng tơi lựa chọn viên đặt tử cung vì có ưu điểm là tăng được nồng độ của dược chất tại nơi thuốc cần phát huy tác dụng (là tử cung đang bị viêm). Bên cạnh đó tử cung của bị lớn, có thể đặt được nhiều viên thuốc vào nhiều vị trí khác nhau của tử cung nên dạng thuốc này giúp tăng được tốc độ khuyếch tán ra tồn bộ cơ quan sinh dục của bị. Chúng tôi quyết định lựa chọn loại khuôn thuốc đặt có kích cỡ trung bình, đường kính 15mm, chiều dài 40mm, khối lượng 2 g/viên. Theo đó, chúng tơi sẽ xây dựng cơng thức để lượng dược chất trong 1 viên tương ứng với 20kg thể trọng, nên một con bò nặng khoảng 200kg sẽ đặt khoảng 10 viên thuốc vào tử cung. Chia nhỏ lượng thuốc ra làm nhiều viên như vậy giúp chúng tơi đặt được thuốc vào nhiều vị trí khác nhau trong tử cung và do đó tạo được điều kiện tốt nhất cho quá trình phân
rã và khuyếch tán của thuốc trong cơ thể, giúp lượng thuốc đưa vào dễ đạt tới sự đồng đều về hàm lượng trên tồn bộ bề mặt cơ quan đích.
Do dược chất sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là chiết xuất thảo dược và hỗn hợp thảo dược, có thành phần phức tạp nên ở bước đầu tiên trong xây dựng quy trình bào chế, chúng tơi tiến hành thử nghiệm với nhiều nhóm tá dược khác nhau và so sánh các chế phẩm thu được, với mục tiêu là lựa chọn được tá dược phù hợp nhất cho các viên đặt bào chế từ những dịch chiết thảo dược được thử nghiệm.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, dược chất được sử dụng là thảo dược và hỗn hợp các thảo dược, trong đó cao thảo dược ban đầu thu được sau khi đông khơ sẽ được sơ bộ hịa tan vào ethanol 20% để tạo thành hỗn dịch chứa dược chất với nồng độ ban đầu đạt mức 200 mg/ml. Tùy theo đặc điểm và bản chất lý hóa của loại dược chất này, chúng tôi quyết định khảo sát để lựa chọn các tá dược có khả năng hịa tan hoặc phân tán được đồng đều nhất dược chất ra toàn bộ viên thuốc, đồng thời đảm bảo được các tiêu chí về chất lượng của thuốc đặt và thực hiện được vai trò hỗ trợ dược chất phát huy tác dụng dược lý.
Tá dược được dùng trong bào chế thuốc đặt có nhiều loại, dựa vào khả năng hịa tan và cơ chế giải phóng dược chất người ta chia chúng ra làm 3 nhóm như sau:
- Nhóm 1: Các tá dược béo khơng tan trong nước nhưng chảy lỏng ở thân nhiệt để giải phóng dược chất;
- Nhóm 2: Các tá dược thân nước hịa tan trong niêm dịch để giải phóng dược chất;
- Nhóm 3: Các tá dược nhũ hóa vừa có khả năng chảy lỏng vừa có khả năng nhũ hóa để giải phóng dược chất.
Để xây dựng quy trình bào chế thuốc đặt hợp lý cho loại dược chất là cao thảo dược trong thí nghiệm, chúng tôi sơ bộ khảo sát với cả 3 nhóm tá dược thuốc đặt từ đó chọn ra loại tá dược phù hợp nhất với đặc điểm và bản chất lý hóa của cao thảo dược mà chúng tơi nghiên cứu.
Nhóm tá dược thứ 1: Các tá dược béo chảy lỏng ở thân nhiệt để giải
phóng dược chất. Các đại diện điển hình của nhóm tá dược này gồm bơ ca cao, các chất thay thế bơ ca cao như butyrol, các dẫn chất của dầu, mỡ, sáp… Nhược
làm tá dược thuốc đặt ở các nước nhiệt đới, lại dễ bị ôi khét, nhất là về mùa hè. Bên cạnh đó khả năng nhũ hóa của nhóm tá dược này kém nên khó phối hợp với các dược chất ở thể lỏng phân cực hoặc dung dịch dược chất trong nước. Do nguyên liệu dược chất chúng tôi sử dụng là cao thảo dược đã được sơ bộ hòa tan trong cồn và nước trong các thí nghiệm ban đầu chúng tơi nhận thấy dược chất khơng phân tán tốt vào nhóm tá dược béo này, nên chúng tơi quyết định khơng lựa chọn nhóm tá dược này trong quy trình bào chế.
Nhóm tá dược thứ 2: Các tá dược thân nước hòa tan trong niêm dịch để
giải phóng dược chất. Đại diện của nhóm này gồm tá dược gelatin – glyceryl, các keo thân nước có nguồn gốc tổng hợp như polyethylenglycol. Chúng tơi nhận thấy nhóm tá dược thân nước này hịa tan và phân tán tốt dược chất là cao thảo dược đã được sơ bộ hòa tan trong cồn lỗng.
Viên thuốc có độ cứng đảm bảo được hình dạng ổn định ở nhiệt độ thường nhưng cũng đủ mềm để khi đặt thử vào tử cung bị thí nghiệm khơng có biểu hiện khó chịu.
Hình 3.4. Viên thuốc bào chế bằng tá dƣợc gelatin - glyceryl
Nhóm tá dược thứ 3: Các tá dược nhũ hóa. Các tá dược nhũ hóa thường
là một chất hoặc hỗn hợp các chất có khả năng nhũ hóa mạnh, khi đặt vào các hốc tự nhiên của cơ thể thì vừa có khả năng hút niêm dịch, vừa có khả năng chảy lỏng để giải phóng dược chất. Tuy nhiên, để đảm bảo khả năng giải phóng được chất một cách chắc chắn người ta thường chỉ sử dụng các tá dược nhũ hóa có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn nhiệt độ của cơ thể. Sau khi khảo sát cả 3 nhóm tá dược chính của thuốc đặt, chúng tôi quyết định lựa chọn tá dược gelatin – glyceryl để xây dựng quy trình bào chế do tá dược này phân tán tốt dược chất và đảm bảo được các tiêu chí của thuốc đặt khi bào chế thử nghiệm.
Xây dựng quy trình bào chế thuốc đặt với tá dược Gelatin-glyceryl:
Các thuốc đặt có thể được bào chế bằng phương pháp đun chảy đổ khuôn, phương pháp nặn và phương pháp ép khuôn. Trong 03 phương pháp trên, phương pháp đun chảy đổ khuôn là thông dụng nhất, được áp dụng ở cả quy mô bào chế nhỏ và quy mô sản xuất cơng nghiệp. Trong quy trình của mình, chúng tơi lựa chọn phương pháp đun chảy đổ khuôn với các khuôn thuốc thủ công 2g để bào chế thử nghiệm. Phương pháp đun chảy đổ khuôn được thực hiện theo 2 giai đoạn (gồm Chuẩn bị dụng cụ và nguyên phụ liệu; Phối hợp dược chất vào tá dược và đổ khuôn).
Chuẩn bị dụng cụ và nguyên liệu:
Khuôn thuốc: Ở quy mô bào chế nhỏ và thử nghiệm trong phịng thí
nghiệm nên chúng tôi sử dụng các khn thủ cơng, mỗi khn 6 viên có đường kính 15mm, chiều dài 40mm, khối lượng 2 g/viên.
Hình 3.5. Khn thuốc đặt thủ cơng loại 6 viên
Nguyên liệu: Các nguyên liệu bào chế gồm dược chất cao thảo dược, gelatin, glyceryl. Vì bào chế trong phịng thí nghiệm với quy mơ thủ cơng nên để đảm bảo được đúng số lượng viên thuốc dự định, khi tính tốn ngun phụ liệu đều cộng vào 10% so với con số chính xác để trừ đi phần hao hụt do dính dụng cụ khi bào chế.
Bào chế tá dược gelatin - glyceryl: Công thức cho khoảng 100g tá dược gelatin – glyceryl, đủ cho khoảng 40 viên thuốc đặt (gồm Gelatin 10g, Glycerin 60g, Nước cất 30g).
Cách pha chế tá dược này như sau: Làm nhỏ gelatin, ngâm và nước cho trương nở hoàn toàn (thời gian khoảng 30 phút). Đun nóng glyceryl lên 60o
C, cho gelatin đã ngâm ở trên vào khuấy cho tới khi tan hoàn toàn.
Phối hợp dược chất vào tá được và đổ khn: Tính lượng dược chất và tá
dược cho số lượng viên thuốc cần đổ. Điều chế tá dược gelatin – glyceryl và để
nguội đến nhiệt độ 40o
C. Cho dung dịch cao được hòa tan sơ bộ trong cồn vào trộn đều. Tiến hành đổ khuôn.
Dỡ khuôn và b o qu n: Sau khi các viên thuốc đã đơng hồn tồn thì dỡ khn và nếu khơng dùng ngay thì tiến hành bảo quản. Ở quy mô pha chế nhỏ thủ công để phục vụ thử nghiệm nên các viên thuốc của chúng tơi được đóng gói riêng từng viên để chống ẩm. Cụ thể, sử dụng một lượt giấy bóng kính bọ ở bên trong và một lượt giấy nhơm bọc ở bên ngồi. Sau khi bọc riêng từng viên, các viên được đựng vào lọ rộng miệng, nút kín và để vào ngăn riêng ở nơi thống mát hoặc ở ngăn mát của tủ lạnh để bảo quản. Các thuốc đặt thảo dược được bào chế theo đúng quy trình đều có thể bảo quản 3 tháng trong điều kiện nhiệt độ phòng và 6 tháng trong ngăn mát của tủ lạnh.
Hình 3.6. Khn thuốc đƣợc mở nắp trong quá trình lấy viên thuốc ra
khỏi khn
Hình 3.7. Sáu viên thuốc thu đƣợc sau một lần đổ khuôn
Nguồn: Nguyễn Văn Thanh và cs. (2016)
3.3.4.5. Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết thảo dược với vi khuẩn Staphylococcus spp. và Streptococcus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò
- Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần.
- Phương pháp pha d ch chiết để thu được dung d ch m (dung d ch với độ đậm đặc, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước vơ khống khi sử dụng) có nồng độ 100 mg/ml: Lấy 1g cao cơ tồn phần pha với 10ml Dimethyl Sulfoxide
(DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn sẽ được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
- Phương pháp pha loãng d ch chiết: Chuẩn bị 10 ống nghiệm vô trùng, cho
vào mỗi ống 5ml DMSO. Lấy 5ml mẫu dịch chiết (100 mg/ml), cho vào ống
nghiệm thứ nhất, làm đồng đều, ta được độ pha loãng 2 lần (21). Lấy 5ml dung
dịch ở ống nghiệm 21 cho vào ống nghiệm thứ 2, được độ pha loãng 4 lần (22).
Cứ làm như vậy được độ pha loãng tiếp theo: 23, 24… 2n.
- Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococcus spp. và Streptococcus spp. trên môi
trường đặc và lỏng:
Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24h, chọn khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong
bình tam giác với mơi trường LB lỏng, đặt trong tủ bảo ôn ở 370C, với tốc độ lắc
200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108
tế bào/ml là đạt chuẩn).
- Xác định mật độ vi khuẩn
Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng λ= 600nm.
- Kiểm tra tác dụng kháng khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuyếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt
108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipet man hút 100µl canh khuẩn
nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ đục cách nhau khoảng
25mm. Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24h đọc kết
quả bằng cách đo đường kính vịng vơ khuẩn, rồi tính số bình quân.
3.3.5.6. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm có nguồn gốc thảo dược đến một số chỉ tiêu lâm sàng của bò
Nghiên cứu được tiến hành trên 36 bị chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 12 bị. Những bị của lơ thí nghiệm và đối chứng có sự tương đồng về thể trạng và chế độ hộ lý, chăm sóc, ni dưỡng và ở thời điểm ngày 1 sau đẻ. Bị ở lơ thí nghiệm thứ nhất được thụt dung dịch thảo dược dạng huyền phù với liều
thí nghiệm thứ 2 được đặt viên thuốc thảo dược với liều là 1 viên/20kg thể trọng vào thời điểm 4h sáng, trong 5 ngày liên tiếp. Bị ở lơ đối chứng được thụt 50ml nước muối sinh lí cùng thời điểm với các bị thí nghiệm ở trên. Chúng tôi chọn thời điểm bắt đầu tiến hành thí nghiệm bị bào 4h sáng để kịp thời gian theo dõi, kiểm tra các thơng số lâm sàng của bị bao gồm: thân nhiệt, nhịp hô hấp, tần số mạch đập, tần số nhu động dạ cỏ, phản ứng co của tử cung vào các thời điểm 6h sáng và 6h chiều của các ngày dùng thuốc. Thân nhiệt của bò được kiểm tra bằng cách đưa nhiệt kế thủy ngân và trực tràng của bò, lưu lại trong trực tràng 30s và xem kết quả. Tần số hô hấp và nhu động dạ cỏ được kiểm tra bằng tai nghe, tần số mạch đập được kiểm tra ở động mạch đùi và mức độ co của tử cung được kiểm tra bằng cách khám tử cung qua trực tràng. Tổng số mỗi bò được kiểm tra 10 lần đối với mỗi chỉ tiêu nói trên.
3.3.5.7. Phương pháp nghiên cứu phòng bệnh viêm tử cung cho bò bằng chế phẩm có nguồn gốc thảo dược
- Nghiên cứu được tiến hành trên 3 nhóm bị, mỗi nhóm 30 con. Nhóm bị thứ nhất được sử dụng làm nhóm đối chứng, khơng được dùng thuốc. Nhóm thứ 2, bị được sử dụng dung dịch huyền phù có nguồn gốc thảo dược liều 01ml/20kg thể trọng. Nhóm 3, bò được sử dụng viên đặt có nguồn gốc thảo dược với liều lượng 1 viên/10kg. Bị ở 3 nhóm có sự tương đồng về dinh dưỡng, chăm sóc và quản lí. Tất cả các bị trong 2 lơ thí nghiệm đều khơng bị sát nhau, khơng bị viêm tử cung được sử dụng thuốc từ ngày 1 sau khi đẻ.
- Thời gian thải dịch sau khi đẻ của bị được thực hiện thơng qua việc quan sát trực tiếp sự thải dịch của tử cung từ thời điểm sau khi đẻ đến lúc hết dịch.
- Hàng ngày, dịch đào thải từ đường sinh dục của bò được theo dõi 2 lần vào sáng và chiều. Các đặc điểm về màu sắc, số lượng dịch, mùi, đặc tính của dịch được theo dõi. Bị được coi là bị viêm tử cung khi từ tử cung thải ra dịch có màu nâu - đỏ, mùi thối, có thể có mủ, bị có các triệu chứng sốt, mệt mỏi, ăn kém và sụt giảm sản lượng sữa, những trường hợp nghi ngờ được kiểm tra lại bằng phản ứng Whiteside test (Fayaz et al., 2014). Để ống nghiệm trong giá đựng cho tới khi dung dịch nguội và đánh giá kết quả như sau:
+ Nếu dung dịch khơng có màu thì được cho là dịch tử cung bình thường; + Nếu dung dịch có màu vàng thì dịch được cho là dịch viêm tử cung.
3.3.5.8. Phương pháp nghiên cứu sử dụng chế phẩm có nguồn gốc thảo dược để điều trị bệnh viêm nội mạc tử cung cho bò
Nghiên cứu được tiến hành trên 03 nhóm bị, mỗi nhóm 25 con. Mỗi nhóm bị được điều trị bằng 1 phác đồ như trình bày ở dưới.
Nhóm đối chứng: Bị được điều trị như sau: Rivanol 0,1%, 3.000ml thụt
rửa tử cung ngày 1 lần, sau khi kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất thụt vào tử cung, ADE, B.complex 10ml tiêm bắp ngày 1 lần, liệu trình điều trị 3 - 7 ngày.
Nhóm sử dụng dung dịch huyền phù có nguồn gốc thảo dƣợc: Tương tự
như phác đồ của nhóm sử dụng kháng sinh chỉ khác ở chỗ thay thuốc kháng sinh Norfloxacin bằng chế phẩm có nguồn gốc thảo dược liều 01ml/10kg thể trọng.
Nhóm sử dụng viên đặt có nguồn gốc thảo dƣợc: Tương tự như phác đồ
của nhóm sử dụng kháng sinh chỉ khác ở chỗ thay thuốc kháng sinh Norfloxacin bằng chế phẩm có nguồn gốc thảo dược liều 1 viên/5kg thể trọng.
Tất cả bị thí nghiệm đều có sự tương đồng về dinh dưỡng, thức ăn, quản lí. Bị được điều trị ngay khi có triệu chứng viêm tử cung (sốt cao, dịch hồng, hơi thối, có mủ). Trước khi tiến hành điều trị bệnh, mẫu dịch tử cung được lấy để kiểm tra