luan an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com moi nhat
1.2.3. Một số phương pháp định lượng nồng độ hormone trong máu * Phương pháp xét nghiệm miễn dịch [40], [49]
* Phương pháp xét nghiệm miễn dịch [40], [49]
+ Kỹ thuật ELISA: ELISA (Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay) là kỹ thuật miễn dịch hóa học để phát hiện kháng thể (KT) hay kháng nguyên (KN) trong mẫu phân tích. Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa KN và KT, KT được gắn với một enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa KT với KN và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ KN hay KT cần phát hiện. ELISA thường được thực hiện trên các tấm nhựa có 96 giếng nhỏ. Mỗi giếng được tráng bởi KT (AB1), KT này đặc hiệu với hormone cần định lượng. Mẫu cần định lượng hoặc mẫu chứng được cho vào vào mỗi giếng, sau đó là là KT thứ hai (AB2), KT này cũng đặc hiệu với hormone nhưng gắn vào một vị trí khác trên phân tử hormone. Một KT thứ ba (AB3) được thêm vào để nhận diện AB2 và được gắn với một enzyme chuyển chất nền thích hợp thành sản phẩm có thể dễ dàng nhận ra bởi phương pháp nhuộm màu hoặc huỳnh quang. Phương pháp ELISA sử dụng lượng dư
27
KT nhằm mục đích tất cả các phân tử hormone đều được gắn và đều tạo ra phức hợp KT - hormone. Do đó, lượng hormone trong mẫu cần định lượng hoặc trong mẫu chuẩn sẽ tỉ lệ thuận với lượng sản phẩm được tạo ra.
+ Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang: Xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang (Chemiluminescent Immuno Assay, CLIA) dựa trên nguyên lý KN (chất có trong mẫu bệnh phẩm) kết hợp với KT (chất có trong thuốc thử) có gắn chất đánh dấu có khả năng phát quang. Các xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang được sử dụng rộng rãi để phân tích nhiều chất quan trọng và có nồng độ thấp như dược phẩm, hormone và các marker sinh học khác.
+ Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch - điện hóa phát quang: Kỹ thuật điện hóa phát quang (Electrode Chemi Luminescence, ECL) sử dụng chất đánh dấu là ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học. ECL có khả năng phát hiện những chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh. Các KT (hoặc KN) gắn biotin và chất đánh dấu ruthenium cùng vi hạt phủ streptavidin được ủ trong hỗn hợp phản ứng. Tín hiệu được đo và kết quả xét nghiệm được xác định qua đường chuẩn xét nghiệm đã được thiết lập.
+ Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch - phóng xạ: Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay, RIA) dựa trên tính đặc hiệu cao của phản ứng miễn dịch, trong đó chất cần định lượng đóng vai trị là KN cùng với KN đồng nhất về miễn dịch nhưng được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (KN*) liên kết với một KT đặc hiệu để tạo thành các phức hợp KN*-KT và KN-KT. Hầu hết các phương pháp hiện nay được tự động với sự hỗ trợ của việc sử dụng các KT ràng buộc vào một ma trận ở pha rắn. Lợi thế quan trọng nhất của RIA trong các phép đo để xác định các hợp chất trong dịch sinh học với độ chính xác và độ nhạy cao mà nó hồn tồn vượt trội so với các kỹ thuật miễn dịch thơng thường khác. Để tăng tính chính xác của xét nghiệm, RIA được thực hiện với một số dung dịch chuẩn của một vài hormone không được gắn ở các nồng độ khác nhau. Sau đó một đường cong chuẩn được vẽ ra. Bằng cách so sánh
28
lượng phóng xạ được ghi nhận từ q trình thí nghiệm với một đường cong chuẩn, ta có thể tính tốn được với sai số từ 10 - 15% nồng độ của hormone trong lượng dịch cần định lượng. Một phần tỷ hoặc phần nghìn tỷ gam hormone có thể được định lượng bằng phương pháp này.
* Phương pháp sắc ký [36], [40]
+ Kỹ thuật sắc ký giấy: Sắc ký giấy là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một hỗn hợp (acid amin). Trong kỹ thuật sắc ký giấy, pha tĩnh được thực hiện trên một bản giấy bằng cellulose, pha động là chất lỏng. Trong khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi và các lỗ rỗng trên bề mặt giấy cellulose sẽ được phủ đầy dung môi. Như thế, các chất tan bị phân tán nhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn. Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì thế quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế phân chia. Những hormone khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bản giấy và tạo thành một sắc ký đồ.
+ Kỹ thuật xét nghiệm sắc ký lỏng khối phổ: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography - mass spectrometry, LCMS) là phương pháp được dùng trong phân tích vết các hợp chất cần định danh chính xác. Phương pháp này thích hợp cho việc nghiên cứu nhiều hormone đồng thời chỉ với lượng huyết tương nhỏ (khoảng 50µl). Ưu điểm nổi bật của LCMS là đo lường chính xác, trực tiếp những hormone steroid và có thể cung cấp những thơng tin liên quan đến nghiên cứu lâm sàng, nghiên cứu điều tra trên diện rộng về các hiệu ứng bệnh lý liên quan đến các steroid [36].