3.1. Quá sao chép ADN
Một trong những tính chất căn bản của chất di truyền ADN là khả năng tự sao chép (replication) chính xác hay tự nhân đôi (self duplication). Ưu tiên nổi bật của mơ hình Watson – Crick là cho phép dự đoán ngay phân tử ADN sao chép như thế nào. Ngay sau
khi mơ hình cấu trúc ADN được nêu ra, nhiều thí nghiệm được tiến hành để xác nhận các dự đốn.
Sao chép theo khn
- Ngay khi nêu ra mơ hình, Watson và Crick đã cho rằng nếu hai mạch của phân tử ADN được tách ra do các liên kết hydro giữa các cặp base bị đứt, mỗi mạch sẽ làm khuôn cần thiết cho việc tổng hợp mạch cặp mới tương tự với mạch cặp trước đó.
- Vì cytosine nên trình tự các nucleotide trên một mạch sẽ xác nhận chính xác trình tự đặc hiệu các nucleotide trên mạch bổ sung với nó.
- Nói cách khác, nếu tế bào tách rời hai mạch của phân tử ADN ra, nó có thể xếp các nucleotide của mạch mới thành hàng theo trình tự bổ sung với các nucleotide trên mạch cũ và sau đó nối các nucleotide mới thành mạch mới bổ sung.
- Như vậy hai mạch cũ của phân tử ADN ban đầu được tách ra, mỗi cái làm khuôn để tổng hợp mạch mới.
- Kết quả của một phân tử ADN ban đầu tạo ra hai phân tử con giống hệt nhau. Mỗi phân tử con đều mang một mạch cũ và một mạch mới.
- Kiểu sao chép này gọi là bán bảo tồn (semi-conservative).
- Năm 1958, M.Meselson và Stahl đã chứng minh kiểu sao chép bán bảo tồn. - Hai ông đã nuôi E.coli nhiều thế hệ trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N15.
- Như vậy tất cả ADN của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15 thay cho N14 bình thường.
- Sau đó tế bào được chuyển sang mơi trường chỉ chứa N14 nhẹ, mẫu các tế bào được lấy ra theo những khoảng thời gian đều đặn và chiết tách ra ADN.
- Bằng phương pháp li tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại ADN nặng, nhẹ và lai được tách ra.
- Kết quả cho thấy ADN nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N15, sau một lần phân chia cho thế hệ I với ADN có hai tỉ trọng nằm giữa ADN nặng N15 và ADN nhẹ N14.
- Nói cách khác sau một lần sao chép phân tử ADN mới chứa một nửa mang N15 và một nử N14.
- Ở thế hệ II một nửa số phân tử ADN là lai, nửa cịn lại ADN nhẹ N14.
- Thí nghiệm này khẳng định giả thuyết của Watson và Crick là đúng tức hai mạch ADN mẹ tách ra, mỗi cái làm khuân để tổng hợp nên mạch mới bổ sung.
- Để khẳng định kết quả ADN lai được làm biến tính để tách rời hai mạch ra, đúng là một mạch chỉ chứa N15, còn mạch kia chỉ chứa N14.
Quátrình sao chép ADN
Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm ra các cơ chế phân tử của quá trình sao chép ADN. Đó là một q trình phức tạp, nhưng phải trải qua các cơ chế chung như:
- Phải có đoạn mồi (prymer) tức đoạn ADN hay RNA mạch đơn ngắn bắt cặp với mạch đơn khuôn;
- Đủ 4 loại nucleoside triphosphat (dATP, dGTP, dTTP và DCTP) bắt cặp bổ sung với các nucleotide mạch khuôn
- Mạch mới tổng hợp theo hướng 5’P ---> 3’ OH;
- Các nucleotide mới được nối lại với nhau bằng liên kết cộng hoá trị để tạo mạch mới.
Mỗi bước được điều khiển bởi enzyme đặc hiệu và được thực hiện một cách nhanh chóng, chính xác.
Ở các Prokaryotea, lẫn Eucaryotae, từng mạch riêng lẻ được sao chép chỉ theo một hướng
- Các enzyme sao chép di chuyển dọc theo mạch mẹ từ đầu 3’ đến 5’ để tạo nên mạch mới bổ sung theo hướng 5’ 3’.
- Phân tử ADN gồm hai mạch đối song song, khi tách hai mạch ở một đầu để sao chép tạo ra chẻ ba sao chép (replication folk).
- Mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’ 3’, nên trên một mạch khn q trình tổng hợp sẽ hướng từ ngồi vào chẻ ba; cịn ở mạch khn kia sẽ tổng hợp theo chiều từ chẻ ba hướng ra ngoài bằng cách tạo ra các đoạn ngắn rồi nối lại với nhau.
- Sau đây là diễn biến sao chép ở nhiễm sắc thể vịng trịn của E.coli. Chi tiết của q trình gồm hai giai đoạn khởi sự (initiation) và nối dài (elongation).
a) Khởi sự
- Ở E.coli quá trình bắt đầu khi một protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao chép (replication origine gọi tắt là ori) và gắn vào trình tự base đặc biệt đó.
- Tiếp theo enzyme gyrase (một loại enzyme topoisomerase) cắt ADN làm tháo xoắn ở hai phía của protein B
- Trong khi hai phân tử enzyme gyrase chuyển động ngược chiều nhau so với điểm ori thì hai phân tử của enzyme helicase (còn gọi là rep) tham gia tách mạch tạo chẻ ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng của ATP làm đứt các liên kết hydro giữa hai base bắt cặp với nhau. Các protein làm căng mạch SSB (Single-strand binding protein = SSB – protein) gắn vào các mạch đơn ADN làm chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không cho chập lại ngẫu nhiên hoặc xoắn để việc sao chép được dễ dàng.
b) Nối dài
- ADN-polymerase III, là một phức hợp gồm nhiều enzyme gắn với nhau, bắt đầu sao chép một trong hai mạch bằng cách gắn vào mạch khuôn và lắp các nucleotide bổ sung vào vị trí tương ứng.
- Một phức hợp là cần thiết vì ADN-polymerase phải xúc tác nhiều bước phản ứng khác nhau và phải có khả năng sử dụng 4 loại nucleotide như chất phản ứng phụ thuộc vào chỗ được đọc trên mạch khn.
- Ít nhất nó phải có 4 trung tâm hoạt động, mỗi trung tâm ứng với một loại nucleotide (A, T, G, C). Ngoài chức năng polymer hoá theo hướng 5’ 3’ và 3’ 5’.
- Khi phức hợp ADN-polymerase đọc theo mạch khuôn và kéo các nucleotide bổ sung vào đúng chỗ nó gắn các nucleotide lại làm mạch mới bổ sung mọc dài ra.
- Trên đường di chuyển để tổng hợp ADN, nếu ADN-polymerase III, gặp chỗ mà nucleotide mới lắp sai vị trí, nó sử dụng hoạt tính exonuclease 3’ 5’ cắt lùi lại bỏ
nucleotide trước khi được gắn vào đầu 3’OH đã được hoạt hoá do ATP để thành nucleoside triphosphate có mang năng lượng.
- ADN-polymerase có tính đặc hiệu cao, nó chỉ thêm nucleotide vào đầu 3’OH của mạch đang được tổng hợp.
- Mạch khn có đầu 3’ được ADN-polymerase III gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ sung 5’ 3’ hướng vào chẻ ba sao chép. Mạch khuôn này được gọi là mạch khn trước, cịn mạch mới được tổng hợp gọi là mạch trước (leading strand).
- Trong khi đó ở mạch khn sau có đầu 5’ việc tổng hợp phức tạp hơn và thực hiện từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài để đảm bảo đúng hướng 5’ 3’.
- Khi mạch kép tách ra, ở gần chẻ ba sao chép, enzyme primase gắn mồi (primer) ARN khoảng 10 nucleotide, có trình tự bổ sung với mạch khuôn ADN-polymerase III nối theo mồi ARN, theo hướng ngược với chẻ ba sao chép, tổng hợp các đoạn ngắn 1000-2000 nucleotide, được gọi là các đoạn Okazaki.
- ADN – polymerase nối dài đoạn Okazaki đến khi gặp ARN mồi phía trước thì dừng lại, rồi lùi ra sau tiếp tục tổng hợp từ ARN mồi được tạo nên gần chẻ ba sao chép.
- Tiếp theo, ADN-polymerase I nhờ hoạt tính exonuclease 5’ 3’ cắt bỏ mồi ARN, lắp các nucleotide của ADN vào chỗ trống và thực hiện polymer hoá hướng 5’ 3’.
- Đoạn ADN gắn 10 nucleotide này còn hở hai đầu, được nối liền chỗ hở nhờ enzyme ligase của ADN. Mạch được tổng hợp từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài được tổng hợp chậm hơn nên gọi là mạch sau (lagging strand).
- Quá trình sao chép ADN ở E.coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến 50.000 nucleotide/phút.
Sao chép ADN trong tế bào
Trong tế bào quá trình sao chép phụ thuộc vào cấu trúc của bộ gen nên tuy tuân theo các nguyên tắc chung vẫn có những khác biệt giữa tế bào Prokaryotae và Eukaryotae.