ADN được tách chiết từ sinh khối ướt theo phương pháp của Fawleys . Lấy vào khoảng 2 - 5 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm lạnh ở 4ºC với tốc độ 8000 - 9000 vòng trong 15 phút và rửa 2 lần bằng 300 l dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5M Na2EDTA, 0.15M NaCl). Sau đó tạo dịch huyền phù trở lại trong 300l đệm 10l TE (10mM Tris - HCl, 1mM EDTA, PH 8.0, tỷ lệ mẫu : đệm, 1:2).
Sau đó bổ sung tiếp 500l dịch phá tế bào (Triston- X100 2% (v/v), 1% SDS, 100 mM NaCl, 1mM EDTA 8.0, 10 mM Tris 8.0), và hạt thuỷ tinh (tỉ lệ 1:2 mg/v), trộn đều cho tan. Tiếp tục bổ sung chloroform : iso amyl alcohol (Tỷ lệ 24:1, v/v) với
thể tích bằng 1/3 thể tích mẫu, trộn đều trong 5-10 phút bằng tay. Cuối cùng bổ sung protein K (Sigma, 20mg/ml proteinase K trong 1/10l TE), ủ mẫu ở 56ºC trong 10 - 15 phút. Sự tan tế bào được xác định bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự tăng độ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước đá 10 phút. Tiếp theo, ly tâm mẫu ở 15000 vòng/phút thời gian 15 - 20 phút để phân lớp. Sau đó chuyển phần nhớt ở pha đầu sang Eppendof (Cỡ 1,5ml) mới và ADN được tách ra bằng bổ sung ethanol lạnh (ethanol 95,5% giữ ở 22ºC) với thể tích gấp đôi thể tích mẫu và 2l của 3M Na-acetate (pH=4,5). Ngâm ADN trong 100l ethanol 70% trong 30 phút và sau đó ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phút. Sợi ADN làm khô bằng nhiệt độ phòng trong 10 phút và được làm tan trở lại trong 50 l đệm 0.1l TE (của 10l TE) ở 4ºC qua đêm.
Dịch đem phân tích bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260 và 280 nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260nm, ở bước sóng 280 chứng tỏ có mặt của protein. Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất đệm, các muối như EDTA và của arn. Các tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 1.0 : 1.8 : 1. Hàm lượng ADN được tính như sau: 1 đơn vị OD (mật độ quang, Optical Durity) ở 260nm tương đương với 50l/mg ADN.
Cách tính: Đơn vị mẫu độ loãng chỉ số/1000 = ADNg/l.
Nếu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và RnazaA
2.8.2. Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR
a. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR Trình tự mồi:
ITS1 F : 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’
ITS4 R : 5’ – TCCTCCGCTTATTGTATGC – 3’
dNTP (2,5mM) 2l Mồi 0,5l (10pmol cho mỗi loại mồi-ngược và xuôi)
10 Taq buffer 2,5l Nước cất 12l
Mẫu (50 - 90ng) 2l Taq polymeraza 0,3l (Taq 5U/ml) Tổng cộng thể tích phản ứng 20 l
b. Chương trình chạy PCR
Biến tính ADN ở 940C trong 3 phút.
Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 940C trong 30 giây. 480C trong 30 giây. 720C trong 1 phút 20 giây. Hết một chu kỳ.
Tổng hợp : 720C trong 10 phút.
Kết thúc chương trình ở 40C nhiệt độ bảo quản.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agaroza
Pha đệm : Chúng tôi tiến hành pha dung dịch đệm 10 TAE Tris 242g Acid axetic 57,1ml 0.5M Na2EDTA pH=8.0 100ml
Thêm Milli-Q pha thành một lít
Trong quá trình chạy điện di dùng dung dịch đệm 1 TAE (của 10 TAE pha loãng dịch 10 lần trong 100ml Milli-Q).
c. Đổ gel
Cân 0,8 - 1,2g agaroza cho vào 100ml dung dịch đệm 1 TAE, đun sôi cho đến khi agaroza tan hết.
Lắc đều để nguội đến 40 - 500C.
Đổ gel vào khay đã cài sẵn lược.
Để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và đặt khay gel vào máy điện di.
d. Tra mẫu
- Tra 1àl của 1 kb ADN ladder (Takara) trộn với 2àl của 6 ì loading buffer dựng như ADN chuẩn.
- Tra mẫu vào từng giếng.
e. Chạy điện di:
Với dòng điện 100V trong thời gian 20-30 phút cho tới khi vạch màu đến 2/3 bản gel.
f. Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad
Kết quả ADN mới được nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình dưới những vạch đỏ màu da cam.
2.8.3. Xác định trình tự gen bằng máy tự động
Nguyên tắc: Việc phân tích trình tự ADN cho phép thực hiện một nghiên cứu tỉ mỉ về ADN, nó cung cấp thông tin cơ bản nhất đó là trật tự các nucleotit, giúp ta có thể tìm ra chức năng và trật tự gen, thực hiện những so sánh về các gen tương ứng giữa những loài khác nhau và phân loại các dạng đột biến. Dựa trên các đoạn mồi đặc hiệu để phân tích trình tự ADN của mẫu, cần xác định trực tiếp từ sản phẩm PCR.
Tiến hành: Tinh sạch sản phẩm PCR: Dùng Spinfilter unit (bộ kít làm siêu sạch sản phẩm PCR), lấy 20àl sản phẩm PCR cho vào Eppendorf, lọc qua spinfilter unit cú bổ sung 50àl chất đệm spinbind sau đú loại bỏ dung dịch bằng siờu ly tõm tốc độ 13000rpm trong 30 giõy. Spinfilter unit được rửa bằng 20àl chất đệm spinclean, đem ly tâm 2 lần với tốc độ 13 000 vòng/phút trong 30 giây. Sau đó spinfilter unit được cài vào một Eppendorf mới. Cuối cùng, tách sản phẩm ADN ra khỏi spinfilter unit bằng siờu ly tõm tốc độ 13000rpm trong 60 giõy cựng với 10àl chất đệm rửa trôi.
- Xác định nồng độ ADN: Sản phẩm ADN sau được đo bằng cappilary cell bước súng 260nm và tớnh theo cụng thức: ADNABS 260 ì 20 ì 50ng/àl.
- Sử dụng kit BigDye Terminator để phân tích trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR: lấy chừng 1àl sản phẩm sạch PCR (từ 30 hoặc 90ng) làm ADN khuụn và 3,2pmol/àl primer cho vào ống PCR tube (0.2ml, MicroAmp PCR), 2àl BigDye.
Tổng thể tớch 20àl. Cỏc mẫu được làm biến tớnh ở 96oC trong 3 giõy rồi thực hiện 25 chu kỳ theo chu trình sau: 96oC trong 3 giây, 50oC trong 5 giây, 60oC trong 4 phút. Bước cuối cùng ở 4oC, thời gian bảo quản.
- Tủa sản phẩm ADN đó nhuộm và gắn với Big Dye: Bổ sung 2àl của 3M Na acetate (pH=4,5) và 500àl của ethanol.
Ly tâm tốc độ 15000 vòng/phút trong 30 phút. Sau đấy mẫu được rửa hai lần trong 500àl của 70% ethanol, loại bỏ etanol dựng ly tõm 15000 vũng/phỳt trong 5 phút. Làm khô mẫu bằng thiết bị khô chân không trong 5 phút.
Cuối cựng bổ sung 15àl Hi - Dye formamide cho việc tỏch rời cỏc nucleotit và trộn nhẹ nhàng trong 1 phút, làm biến tính trong nước sôi 2 phút.
Làm lạnh ngay trong nước đỏ khoảng 5 phỳt. 10àl mẫu tra vào giếng của khay mẫu và được phân tích trong thiết bị đọc trình tự tự động ABI Prism 3100 Avant.
2.9. Xác định thành phần acid béo