Chương 2 PHƯƠNG PHÁP
2.9. Xác định thành phầnacid béo
Xác định thành phần acid béo [28]
Lấy 50mg mẫu cho vào ống thuỷ tinh nút vặn (cỡ 13mm 100mm). Alkal
hoá bằng 1,0ml chất phản ứng I (reagent I, gồm 15g sodium hydroxide (NaOH),
50ml methanol và 50ml Milli-Q). Tế bào được thuỷ phân ở 1000C tại nồi nhiệt khô trong 5 phút. Sau đó làm huyền phù bằng Vortex trong 5 giây rồi tiếp tục cho thuỷ phân trong 25phút. Dịch thuỷ phân được làm lạnh ở nhiệt độ phòng. Methyl hoá
dung dịch alkal với 0,2ml chất phản ứng 2 (65ml 6N hydrochloric acid và 55ml
methanol). Sau khi methyl hóa, giữ ở 800C trong nồi cách thuỷ khoảng 10 phút. Dung dịch methyl hoá được bổ sung 1,25ml của chất thử 3 (gồm 50ml n-hexane-
methyl tert butyl ether, 1:1, v/v) và được trộn đều bằng máy lắc 2000 vòng/phút
trong 10 phút. Dịch nhớt phía trên được loại bỏ. Dung dịch được bổ sung 3ml thuốc thử 4 (1,2g sodium hydroxyde trong 100ml Milli-Q) và được trộn đều bằng tay trong 5 phút. Ly tâm ở 2,500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch trên cùng được chuyển sang ống thuỷ tinh mới có nút vặn và cho bay hơi bằng khí nitrogen thơng thường tới khi khơ. Cuối cùng, toàn bộ dịch mẫu được làm tan với 50l của diethyl ether 300 (hoặc acetone - 300, n-hexane). Toàn bộ mẫu được chấm vào sắc ký bản mỏng (TLC) rồi được đặt trong bồn thuỷ tinh chứa 100ml n-hexane-diethyl ether (4:1, v/v) trong 30 – 45 phút. Thành phần acid béo được hiện vệt bằng iot trong 30 – 45 phút. Acid béo có cực và không cực xuất hiện như nhữngvệt xanh. Những vệt được
cạo và được rửa giải hai lần bằng diethyl ether 300. Trộn đều dung dịch silicagel trên máy lắc 2000 vòng/phút trong 10 phút và ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 hoặc 10 phút. Dung dịch được bay hơi bằng khí nitrogen thơng thường tới khi khơ. Mẫu
được hồ tan trở lại với 50l chất phản ứng 3. Dùng pipet nhỏ vào lọ nhỏ GC có nút đậy. Sau đó đem phân tích trên máy sắc ký khí (gas chromatography).
Cơng thức tính kết quả: st Cst R Asp C 1 A
Trong đó : C : là nồng độ acid béo có trong mẫu [Cst] : nồng độ chất chuẩn
R : độ thu hồi của phương pháp
[Asp] : là diện tích trung bình cấu tử có trong mẫu
[Ast] : là diện tích trung bình của cấu tử có trong chất chuẩn