Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.6. Xây dựng hệ thống nuôi cấy vi tảo biển
3.6.2. Quy trình nuôi cấy vi tảo biển
Quy trình nuôi cấy vi tảo được thể hiện hình 3.23. Giống vi tảo thuần khiết được lưu trữ, bảo quản tại phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia, Hà Nội và cung cấp giống cho hệ thống nuôi cấy.
3.6.2.1. Nhân nuôi giống gốc (nuôi cấy vô trùng, không cần sục khí)
Dung dịch giống vi tảo thuần khiết (20-100ml) từ phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học được chuyển xuống trại giống. Nguồn giống này được lưu giữ trong điều kiện nhiệt độ ổn định 20°C, chiếu sáng nhân tạo (đèn neon) trong thời gian 3 ngày. Sau đó được sử dụng cho nhân nuôi giống gốc tại trại sản xuất giống trong các bình tam giác 100ml, 250ml hoặc 500ml. Các bình nuôi cấy và môi trường được khử trùng ở 121°C trong 15 phút. Tuy nhiên nếu không có nồi khử trùng chuyên dụng có thể sử dụng các thiết bị bếp gas hoặc điện để khử trùng, các bình chứa môi trường có nắp đậy bằng màng nhôm giữ trong nước nóng 70-80°C, thời gian 30 phút. Môi trường dinh dưỡng trong bình không nên đun sôi vì như thế sẽ làm thay đổi giá trị dinh dưỡng của môi trường. Mục đích của khử trùng nhằm giảm thiểu nguy cơ nhiễm các mầm bệnh và các loài tảo khác trong bình trước khi bắt đầu nuôi cấy.
Cấy chuyển giống là cần thiết cho lưu giữ giống vi tảo trong thời gian dài, nhằm mục đích đáp ứng đủ về số lượng, thành phần và kịp thời giống cho quá trình sản xuất. Nhiễm khuẩn có thể xảy ra bất kể lúc nào trong quá trình nuôi cấy, gây ảnh hưởng lớn đến các giai đoạn sản xuất tiếp theo. Vì vậy, việc cấy chuyển giống nên được tiến hành trong tủ cấy vô trùng để giảm khả năng nhiễm khuẩn từ không khí. Rất ít các trại giống có tủ cấy nên có thể thay thế bằng cách thực hiện trong một buồng kín đơn với trần mở hoặc khoảng làm việc phân vùng với đèn cồn hoặc đèn Bunsen (gas). Việc cấy chuyển phải được thực hiện cẩn thận, tránh tiếp xúc bề mặt khi cấy chuyển từ bình này sang bình khác. Giống nuôi cấy ở giai đoạn này có thể lưu giữ từ 7-14 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ và nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng yếu 500-1000 Lux. Tiến hành cấy chuyển 1- 10ml giống thuần khiết sang các bình tam giác 100-500 ml chứa môi trường dinh dưỡng. Giai đoạn này chủ yếu là nuôi cấy tĩnh không cần sục khí, lắc đều 2 lần mỗi ngày.
3.6.2.2 Nhân nuôi giống cấp 1 (nuôi cấy vô trùng, sục khí)
Sau 7-14 ngày nuôi cấy, vi tảo giống gốc được cấy san 100-300ml sang các
bình thể tích 2-5 lít để tạo giống cấp 1 (hình 3.24). Mục đích là giai đoạn nuôi cấy này làm gia tăng mật độ tế bào vi tảo (trong khoảng 8-15 ì 106tế bào/ml). Nuụi cấy ở nhiệt độ 20-22°C, tăng cường chiếu sáng 4.000 Lux, sục khí liên tục và định kỳ bổ sung khí CO2.
Hình 3.24. Nhân nuôi giống vi tảo cấp 1 trong bình tam giác và bình nhựa 2-5 lít Sau 5-7 ngày nuôi cấy tiếp theo, tiến hành cấy chuyển 500ml giống ở giai đoạn này sang các bình 2-5 lít chứa môi trường mới đây chính là giai đoạn trung gian giúp tăng cường sinh khối các chủng giống trong pha sinh trưởng. Lượng giống còn lại ở mỗi bình tiếp tục được duy trì nuôi cấy trong 5-7 ngày sử dụng làm
nguồn giống cho nhân nuôi sinh khối ở quy mô lớn hơn.
3.6.2.3. Nhân nuôi sinh khối (không cần vô trùng, sục khí liên tục)
Khi giống cấp 1 đạt tới pha sinh trưởng với mật độ tế bào khoảng 6-10 ì 106/ml, có thể vừa dùng làm giống cho cấy chuyển ở giai đoạn nhân nuôi giống cấp 1, lại là nguồn giống cho nhân nuôi sinh khối trong hệ thống túi plastic 30-60 lít (hình 3.25). San cấy 1-2 lít giống từ các bình giống cấp 1 sang túi plastic 30-60 lít.
Nuôi cấy ở nhiệt độ 22-25°C, tăng cường chiếu sáng >4.000 Lux, sục khí liên tục và định kỳ bổ sung khớ CO2. Giai đoạn nuụi cấy này khi mật độ đạt lớn hơn 2 ì 106tế bào/ml, dùng làm thức ăn cho ấu trùng, con giống, con bố mẹ sinh sản hoặc cấy chuyển để tăng lượng giống cho nhân nuôi sinh khối ở quy mô lớn hơn từ 500-1000 lít.
Hình 3.25. Nhân nuôi sinh khối vi tảo trong túi plastic 30-60 lít
Chú ý giảm thiểu tối đa sự lây nhiễm trong nuôi cấy, tuy nhiên không tránh khỏi nhiễm khuẩn trong khi nuôi cấy. Cần để ý các hiện tượng sau: bọt xuất hiện trên bề mặt hoặc khối vi tảo và nước trở nên đục đây là các hiện tượng cho thấy nhân nuôi sinh khối vi tảo đã bị nhiễm nặng và lượng sinh khối này nên được loại
bỏ. Hệ thống thùng, bể nuôi cấy và các thiết bị sục khí được làm sạch bằng chlorine, sau đó rửa kỹ lại bằng nước và cồn (75 - 85%). Nhân nuôi sinh khối trong thùng hoặc bể 500-1000 lít, các thùng hoặc bể này được làm sạch kỹ bằng nước ngọt sau khi rửa bằng chlorine.