SacI (1, 2, 3, 4, 5: Plasmid pPLK/SacI; M: marker)
Kết quả điện di đồ cho thấy, các giếng 1-5, khi đƣợc cắt bằng enzyme SacI, plasmid pPLK đƣợc cắt mở vịng thành đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 4500 bp,
1 2 3 4 5 M bp
←4000 ←2000 ←1000
đúng với kích thƣớc vector biểu hiện pPLK theo tính tốn lý thuyết. Các băng đều sạch và rõ nét, chứng tỏ vector pPLK cắt bằng SacI đã đƣợc tinh sạch thành công.
Plasmid pPLK sau tinh sạch đƣợc biến nạp bằng xung điện vào tế bào nấm men P. pastoris X33 với điều kiện 1,5 kV; 200 Ω. Tế bào nấm men sau khi biến nạp đƣợc cấy trải và chọn lọc trên mơi trƣờng YPDS có bổ sung kháng sinh 100 g/ml zeocin. Tế bào nào có khả năng biểu hiện gen kháng zeocin mới phát triển đƣợc trên đĩa thạch, cho khuẩn lạc tròn, màu trắng. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ đƣợc nhặt nuôi trong môi trƣờng YPD, nuôi lắc 200 rpm, 28oC, qua đêm, tách DNA để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen lk trong genome
nấm men. Sản phẩm DNA sau tách chiết đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose, nhuộm EtBr và quan sát kết quả dƣới ánh sáng tia tử ngoại bƣớc sóng 245nm.
A B
C
Hình 3.7. Điện di đồ (A) sản phẩm tách DNA nấm men (1-4) ;(B) sản phẩm PCR
bộ gen nấm men P. pastoris X33 với cặp mồi pPLKF-pPLKR (1: đối chứng âm; 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR; M: marker); (C) sản phẩm PCR bộ gen nấm men P. pastoris X33 với cặp mồi 5'AOX1-3'AOX1 (1: đối chứng âm; 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR; M: marker) 1 2 3 4 1 M 2 3 4 5 2000→ 1500→ 1000→ 1 M 2 3 4 5
Kết quả tách chiết DNA genome nấm men theo điện di đồ cho thấy, các băng DNA tách chiết đƣợc sạch, rõ ràng và không đứt gãy, đủ tiêu chuẩn để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR (Hình 3.7A).
Để xác định chính xác gen ngoại lai có đƣợc chèn vào genome nấm men cùng plasmid tái tổ hợp hay không, chúng tôi sử dụng DNA nấm men này để làm khn kiểm tra sự có mặt của gen lk trong genome nấm men bằng phản ứng PCR
với cặp mồi đặc hiệu pPLKF- pPLKR (bảng 2.5). Ngồi ra, genome nấm men cịn đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn DNA nằm gi a 2 trình tự 5’AOX1 và 3’AOX1. Cặp mồi xuôi và ngƣợc sử dụng trong PCR đƣợc cung cấp bởi hãng NewEngland Biolabs có trình tự nhƣ sau: 5’AOX1- GACTGGTTCCAATTGACAAGC
3’AOX1- GCAAATGGCATTCTGACATCC
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose, nhuộm EtBr và quan sát kết quả dƣới ánh sáng tia tử ngoại bƣớc sóng 245nm.
Kết quả điện di đồ cho thấy, khi tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc 1 băng với kích thƣớc khoảng 850 bp, đúng với kích thƣớc gen lk (Hình 3.7B). Khi tiến hành PCR với cặp mồi AOX1, các giếng 2, 3, 4 thu đƣợc 2 băng với kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 2200 bp- kích thƣớc vùng AOX1 trên genome nấm men và khoảng 1400 bp- kích thƣớc gen lk đƣợc chèn vào vùng MCS gi a 2 trình tự mồi
xuôi (5’AOX1) và mồi ngƣợc (3’AOX1) trên vector pPICZαA (Hình 3.7C). Kết quả này đúng với tính tốn lý thuyết. Nhƣ vậy, có thể kết luận đoạn pPLK/SacI đã đƣợc chèn vào genome của nấm men P. pastoris X33, tạo thành công chủng tái tổ
hợp P. pastoris X33 mang gen lk (XpPLK).
3.2.2. Sàng lọc các dòng P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp
Để kiểm tra kết quả và mức độ biểu hiện rLK, 32 dịng tái tổ hợp có genome mang đoạn chèn (XpPLK) đƣợc nuôi biểu hiện trong môi trƣờng YP bổ sung 0,5% methanol sau mỗi 24 giờ. Sau 96 giờ cảm ứng, ly tâm thu dich nổi và thử hoạt tính thủy ph n trên đĩa fibrin, ủ đĩa 37oC trong 5 giờ và đo vịng hoạt tính.
Kết quả cho thấy 17 dịng biểu hiện có hoạt tính thủy phân fibrin là các dòng X1, X5, X6, X7, X8, X10, X16, X18, X19, X20, X22, X25, X26, X28, X29, X31,
X32. Khi nhỏ dịch nổi sau biểu hiện 96 giờ từ các dòng này, trên đĩa fibrin xuất hiện vòng trịn thủy phân trong suốt. Trong khi đó, mẫu Xp là dịch nổi biểu hiện của chủng P. pastoris X33/pPICZαA không chứa gen lk và các dịng khác khơng xuất
hiện hoạt tính. Trong các dịng có hoạt tính, dịng X29 có hoạt tính cao nhất đạt 2,47 U/mg (Hình 3.8). Dịng này đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.8. Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin của dịch nổi thu từ các dòng P. pastoris
X33/ pPLK tái tổ hợp
3.2.3. Biểu hiện P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp
Để kiểm tra chính xác hơn sự tổng hợp protein rLK, quan sát kích thƣớc và mức độ biểu hiện của protein rLK, mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch ni cấy các dịng có hoạt tính thủy ph n fibrin đƣợc tủa acetone, biến tính và chạy điện di trên gel polyacrylamide 12,5%. Sau điện di, bản gel đƣợc nhuộm bạc để quan sát kết quả.
Kết quả điện di đồ cho thấy, ở các giếng 3-7, xuất hiện băng kích thƣớc khoảng 47 kDa khá đậm, băng này không xuất hiện ở chủng P. pastoris/ pPICZαA. Nhƣ vậy, có thể kết luận đã biểu hiện đƣợc protein tái tổ hợp rLK trong nấm men P.
pastoris X33. Kích thƣớc protein biểu hiện đƣợc cao hơn so với tính tốn lý thuyết
Hình 3.9. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp (1: chủng P. pastoris X33/pPICZαA; 2-7: dịch nổi chủng P. pastoris X33/pPLK; M: marker)
3.2.4. Tối ƣu môi trƣờng biểu hiện
Bảng 3.1. Hoạt tính rLK ở các mơi trƣờng biểu hiện khác nhau
Môi trƣờng OD (600 nm) Hoạt tính rLK (U/ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Hoạt tính rLK (U/mg) BMMY 9,755± 0,009 0,112 0,267 0,419± 0,121 MMY 9,575± 0,013 0,112 0,211 0,530± 0,155 MM 6,870± 0,013 0,101 0,178 0,567± 0,062 YPM 8,725± 0,017 0,311 0,259 1,200± 0,090 YPTM 9,325± 0,023 0,435 0,271 1,605± 0,049 YPTCM 9,640± 0,021 0,767 0,289 2,654± 0,071 1 2 3 4 5 6 7 M kDa ←66 ←45 ←35 ←25 ←18
Để khảo sát mức độ biểu hiện rLK trên các môi trƣờng khác nhau, chủng P.
pastoris tái tổ hợp đƣợc ni biểu hiện trong các mơi trƣờng khác nhau có cảm ứng
bằng 0,5 % methanol sau mỗi 24 giờ. Sau 96 giờ cảm ứng, dịch nổi đƣợc thu nhờ ly tâm 12000 vòng/phút, trong 5 phút. Kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrin cho thấy mơi trƣờng YPTCM thích hợp nhất cho biểu hiện rLK (đạt 0,767 U/ml) (Bảng 3.1). Môi trƣờng này đƣợc bổ sung triton X100 là chất hoạt động bề mặt, casamino acid là các acid amin- sản phẩm thủy phân của casein. Hai thành phần này có thể làm tăng mức độ sinh trƣởng tế bào, từ đó làm tăng khả năng sinh tổng hợp rLK ở nấm men.
Hình 3.10. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch tối ƣu
môi trƣờng biểu hiện (1: chủng P. pastoris X33/pPICZαA; 2-7: dịch nổi chủng P. pastoris X33/pPLK trong các môi trƣờng BMMY, MMY, MM, YPM, YPTM, YPTCM; M: marker).
Kết quả này có sự khác biệt so với kết quả khảo sát điều kiện môi trƣờng biểu hiện rLK của Hu và cs (2005), các tác giả khi sử dụng 6 loại môi trƣờng tƣơng ứng cho kết quả biểu hiện ở môi trƣờng YPM là cao nhất với hoạt tính dịch nổi đạt 2,5. 106 U/L sau 96 giờ nuôi cấy [29].
1 M 2 3 4 5 6 7 66→ 45→ 35→ 25→ 18→
Protein ngoại bào thu từ dịch nuôi cấy trên các môi trƣờng biểu hiện khác nhau đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12,5% và nhuộm bạc. Kết quả điện di đồ cho thấy, ở các môi trƣờng BMMY, YPM, YPTM và YPTCM đều xuất hiện băng protein kích thƣớc khoảng 47 kDa. Protein biểu hiện mạnh và cho băng điện di đậm nhất ở môi trƣờng YPTCM. Nhƣ vậy, môi trƣờng YPTCM đƣợc chúng tôi lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.5. Tối ƣu nồng độ methanol
Trong quá trình biểu hiện, methanol đƣợc bổ sung với vai trò cảm ứng promoter AOX1 kiểm sốt q trình sinh tổng hợp enzyme. Mức độ biểu hiện rLK khác nhau khi đƣợc cảm ứng methanol ở các nồng độ khác nhau. Khảo sát dải nồng độ methanol từ 0- 2%, nhận thấy, hoạt tính của rLK tăng dần và đạt cực đại khi cảm ứng 1% methanol (2,962 U/mg) sau mỗi 24 giờ. Hoạt tính cịn lại 81% ở 2% methanol (Hình 3.11).
A
B