CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp đĩa fibrin của Astrup và Mullertz, sử dụng plasmin (yếu tố thủy phân fibrin có sẵn trong cơ thể ngƣời) làm chuẩn [9].
Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân fibrin bằng LK tạo vịng trịn trong suốt.
Đo đƣờng kính, tính diện tích vịng phản ứng. Hoạt tính thủy phân fibrin của rLK đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn plasmin.
Tiến hành:
Chuẩn bị đĩa: Mỗi đĩa petri đƣờng kính 10 cm chứa 10 ml dung dịch
fibrinogen tinh khiết trong NaCl 0,9% (nồng độ 0,2%) đƣợc ngƣng kết bằng 15 µl thrombin (100 UI/ml). Chú , đĩa đặt ở vị trí phẳng, dung dịch đƣợc đổ cho đồng đều, tránh tạo bọt khí. Đĩa đƣợc để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ để fibrin đơng tụ hồn tồn.
Ủ phản ứng: Nhỏ từng giọt 10 μl dịch enzyme lên đĩa (giọt phải tròn), ủ 37o C trong 5 giờ. Khi đơng tụ, fibrin có màu trắng đục, do đó, các vùng bị thủy phân trở nên trong suốt, dễ dàng quan sát bằng mắt thƣờng. Sau 5 giờ, đo đƣờng kính, tính diện tích vịng phản ứng. Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
Xây dựng đường chuẩn plasmin: Để xác định chính xác hoạt tính của
enzyme nghiên cứu cần xây dựng đƣờng chuẩn hoạt tính. Hoạt tính của enzyme thủy ph n fibrin thƣờng đƣợc so sánh với hoạt tính của plasmin, là enzyme thủy ph n fibrin trong cơ thể. Plasmin (0,3 UI/ml) đƣợc pha trong đệm potassium phosphate 50 mM; pH 7,4. Nhỏ dung dịch enzyme lên đĩa fibrin (0,3- 9 mU), ủ 37oC trong 5 giờ rồi đo diện tích vịng phản ứng.
Đƣờng chuẩn plasmin chỉ tuyến tính trong dải hoạt độ từ 0- 10 mU. Do đó, chúng tơi chọn dải này để xác định hoạt tính thủy phân fibrin của enzyme trong q trình thí nghiệm. Đƣờng chuẩn có phƣơng trình: y= 22,61x + 2,762 (Hình 2.1). Trong đó, y là diện tích vịng phản ứng (mm2) và x là hoạt độ enzyme (mU).
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn plasmin (Sigma)