CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli
Nguyên lý: Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10B theo
phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Tế bào E. coli DH10B đƣợc xử lý với CaCl2
giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng tạo điều kiện cho các ph n đoạn DNA đi vào dễ dàng.
Tiến hành:
Chuẩn bị tế bào khả biến: Một khuẩn lạc E. coli DH10B đƣợc nuôi lắc trong
2 ml LB lỏng, lắc 200 rpm ở 37oC qua đêm. Tiếp giống 1% và nuôi lắc ở 37oC trong 2-3 giờ để OD600nm đạt 0,4- 0,7. Dịch nuôi cấy đƣợc để lạnh 30 phút cho ổn định. Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút, thu tế bào. Tế bào đƣợc rửa lần 1 với 0,1 M CaCl2 trong 1 giờ. Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút, thu tế bào và rửa lần 2 với 0,1 M CaCl2 trong 20 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút thu tế bào. Tế bào đã qua xử l đƣợc hòa trong 100 μl 0,1 M CaCl2, bổ sung 15% glycerol, trộn đều,
chia nhỏ tế bào vào mỗi ống eppendorf để chuẩn bị biến nạp. Tế bào đƣợc bảo quản ở -80oC cho nh ng lần biến nạp sau. Các thao tác đƣợc thực hiện ở điều kiện 40C.
Biến nạp plasmid vào E. coli DH10B: Dịch nối ghép đƣợc ủ với tế bào khả biến trong đá 20 phút và sốc nhiệt 45 giây ở 42oC rồi chuyển ngay vào đá. Sau 5 phút ủ trong đá, dịch vừa sốc nhiệt đƣợc bổ sung 250 μl LB lỏng, lắc 200 rpm ở 37oC trong 1 giờ. Dịch biến nạp đƣợc trải trên đĩa thạch chứa kháng sinh phù hợp vector sử dụng (100 μg/ml ampicilin hoặc zeocin ). Đĩa thạch sau đó đƣợc ủ 37oC qua đêm.