CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.17. Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS PAGE)
Nguyên lý: Gel polyacrylamide đƣợc sử dụng để điện di protein với nồng độ
12,5% polyacrylamide theo phƣơng pháp điện di biến tính của Leammli và cs (1970) [43]. Theo đó, các phân tử protein trong mơi trƣờng có SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sê di chuyển về cực dƣơng trong điện trƣờng với tốc độ phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của chúng.
Tiến hành:
Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dƣới là gel tách đƣợc đổ cách mặt
trên 1,5 cm, để đơng hồn tồn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cơ phía trên, cài lƣợc để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đơng hồn tồn và ổn định. Thành phần gel nhƣ bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5%
STT Thành phần Gel tách (ml) Gel cô(ml)
1 H20 khử trùng 1,94 1,18 2 Dung dịch A 1,5 3 Dung dịch B 0,5 4 Dung dịch C 2,5 0,3 5 Dung dịch D 0,06 0,02 6 APS 0,024 0,01 7 TEDMED 0,005 3,5
Biến tính mẫu: Mẫu protein đƣợc bổ sung đệm xử lý mẫu dye 6x với tỷ lệ
Điện di: Bản gel đƣợc lắp vào hệ thống điện di và chạy với cƣờng độ dịng
điện là 20 mA cho lớp gel cơ và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút. Sau điện di, bản gel đƣợc tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 1- 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy, hoặc nhuộm với 0,1% (w/v) AgNO3 theo quy trình của Bassam và cộng sự (1991) có biến đổi [10] nhƣ sau: Ng m bản gel trong dung dịch A1, lắc nhẹ 20 phút để cố định bản gel. Lắc tiếp với dung dịch A2 trong 10 phút. Rửa với H2O cất bằng cách lắc nhẹ trong 10 phút. Chuyển bản gel vào dung dịch A3, lắc nhẹ trong 1 phút, sau đó rửa sạch bản gel 3 lần với H20 cất trong 1 phút. Nhuộm bản gel với dung dịch A4 trong tối 30 phút. Rửa bản gel 3 lần với H20 cất trong 1 phút. Hiện màu bản gel với dung dịch A5, lắc nhẹ nhàng cho đến khi băng xuất hiện. Dừng phản ứng hiện màu với dung dịch A6. Rửa bản gel với nƣớc cất, quan sát kết quả bằng mắt thƣờng.
2.2.18. Nhận dạng protein ngoại lai bằng kĩ thuật MALDI- TOF (MS/ MS) (Matrix-assisted laser desorption ionization- Time of flight)
Khối phổ là kỹ thuật ph n tích đo phổ về khối lƣợng của các ph n tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trƣờng. Mẫu đƣợc ion hóa trở thành các ph n tử tích điện khác nhau và đƣợc ph n tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. D liệu phổ khối đƣợc tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các cơng cụ tin sinh học. Có 2 loại nguồn ion hóa mẫu hay đƣợc sử dụng đó là nguồn MALDI và ESI. MALDI là thuật ng chỉ phƣơng pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lƣợng laser (Matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI). Nguồn MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dƣới tác dụng của năng lƣợng laser lớn.