CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.13. Xử lí DNA plasmid bằng enzyme cắt giới hạn
Nguyên lý: Để kiểm tra dịng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong
muốn hay không, các plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc đƣợc cắt bằng các enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt sợi DNA kép ở một trình tự nucleotide đặc hiệu, ở điều kiện nhiệt độ thích hợp (thƣờng là 37oC, tùy thuộc từng loại enzyme). Các enzyme này đƣợc thiết kế ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai.
Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc trộn với tỉ lệ sử dụng theo hƣớng dẫn
của hãng sản xuất. Ủ trong 2-3 giờ ở 37oC, sau đó điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose.
2.2.14. Tinh sạch DNA từ gel agarose
Nguyên lý:
Sử dụng loại cột có chứa các hạt sepharose để bắt gi các phân tử DNA sợi kép đƣợc gắn với các loại ion trong đệm gắn (Binding buffer- BB). Khi hỗn hợp DNA đi qua cột, các phân tử DNA sẽ gắn vào mạng lƣới, các thành phần khác nhƣ protein, muối… sẽ bị rửa trôi bằng đệm rửa (Wash buffer- WB). Sau đó, để tách DNA ra khỏi cột ngƣời ta sử dụng loại đệm có độ ion hóa thấp là đệm thơi mẫu (
Elution buffer- EB). Có thể thay thể đệm này bằng nƣớc khử ion vơ trùng, nƣớc có khả năng tạo nên một lớp vỏ hydrate và tách DNA ra khỏi cột
Tiến hành: Quá trình tinh sạch sử dụng kit tinh sạch Gel Purification Kit
(Bioneer, Hàn Quốc). Thu phần gel có DNA quan tâm vào ống eppendorf khử trùng. Bổ sung 2 lần thể tích đệm gắn DNA (BB). Ủ hỗn hợp ở 60oC cho tới khi gel tan hoàn toàn. Dùng pipet hút dịch đƣa vào cột (có kèm theo kit của hãng), để ở nhiêt độ phòng 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút, loại bỏ dịch dƣới ống. Bổ sung 500 μl đệm rửa (WB chứa 70% ethanol), để 30 giây ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút để loại bỏ hết cồn. Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 40 μl đệm EB hoặc nƣớc khử ion vô trùng, gi ở nhiệt độ phòng 5 phút để DNA đƣợc hòa tan hồn tồn. Ly tâm 13000 vịng/phút, trong 1 phút thu DNA. Sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose và bảo quản DNA ở -20oC.
2.2.15. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện điện
Nguyên lý: Dƣới tác dụng của nguồn điện, thành tế bào nấm men thay đổi,
tạo điều kiện cho DNA plasmid đi vào dễ dàng. Vector tái tổ hợp đƣợc hội nhập với genome tại điểm AOX1.
Tiến hành:
Chuẩn bị tế bào khả biến P. pastoris X33: Một khuẩn lạc nấm men đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng YPD lỏng, lắc 200 rpm, 30oC, qua đêm. Tiếp giống 0,2% vào 20 ml YPD lỏng, ni lắc trong vịng 16-18 giờ, OD600nm đạt 1,4- 1,6. Dịch nuôi đƣợc để lạnh 30 phút cho ổn định. Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút thu tế bào. Tế bào đƣợc rửa với H20 cất vơ trùng, ly tâm 4000 vịng/phút, trong 5 phút thu tế bào. Lặp lại bƣớc này 2 lần. Tế bào đƣợc bổ sung 1 M sorbitol, ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút thu tế bào. Tế bào sạch đƣợc hòa tan trong 100 μl 1 M sorbitol chuẩn bị cho biến nạp.
μl (50 μl plasmid, 10 μl đệm 10x SacI, 5 μl SacI (5 U), 35 μl H2O), đƣợc ủ 37oC qua đêm. pPLK/SacI đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch Thermo Scienticific (Quy trình tƣơng tự nhƣ tinh sạch DNA gel agarose). Sản phẩm sau tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose và chuẩn bị cho biến nạp.
Biến nạp plasmid vào P. pastoris X33: Dịch tế bào khả biến đƣợc bổ sung dịch plasmid tái tổ hợp đã xử lý với SacI. Để hỗn hợp ổn định 15 phút, chuyển vào cuvette (khử trùng) để xung điện với điều kiện: 1,5 kV, 25 uF, 200 Ω. Bổ sung ngay 1 ml 1 M sorbitol, để lạnh 15 phút. Chuyển toàn bộ dịch biến nạp sang ống eppendorf khử trùng, ủ 30oC trong 1-2 giờ. Dịch biến nạp đƣợc trải trên đĩa YPDS agar chứa 100 μg/ml zeocin, ủ 30oC trong vòng 3-5 ngày. Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch chứa gen kháng zeocin đƣợc nuôi trong môi trƣờng YPD có bổ sung 100 μg/ml zeocin để tách DNA kiểm tra gen chèn.
2.2.16. Tách chiết DNA tổng số nấm men
Nguyên lý: Tế bào đƣợc phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh. Loại
protein bằng chloroform: isoamyl và thu DNA nấm men bằng cách kết tủa với isopropanol.
Tiến hành: Tế bào nấm men đƣợc nuôi trong 5 ml môi trƣờng YPD qua đêm
ở 28oC, lắc 200 rpm. Dịch ni đƣợc ly tâm 8000 vịng/phút, trong 5 phút, thu cặn tế bào. Bổ sung vào cặn 300 μl dung dịch IV, lắc nhẹ cho tan. Hỗn hợp đƣợc ủ - 84oC, 15 phút, sau đó cho ngay vào 95o
C, ủ 1 phút, lặp lại 3 lần. Hỗn hợp đƣợc bổ sung tiếp 250 μl dung dịch 24:1, lắc kỹ và ly tâm 12000 vòng/phút, trong 20 phút. Dịch trên đƣợc thu sang ống mới, bổ sung 300 μl ammonium acetate, để lạnh 15 phút, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút, thu dịch trên. DNA đƣợc tủa bằng 600 μl isopropanol, ủ -84oC, 10 phút, ly tâm thu tủa ở 12000 vòng/phút, trong 10 phút. Tủa đƣợc rửa với ethanol 70%, ly tâm thu tủa, để khô ở 37oC. Sau đó, tủa đƣợc hòa trong 30 μl TE và 0,25 μl RNase, ủ 37o
2.2.17. Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS- PAGE)
Nguyên lý: Gel polyacrylamide đƣợc sử dụng để điện di protein với nồng độ
12,5% polyacrylamide theo phƣơng pháp điện di biến tính của Leammli và cs (1970) [43]. Theo đó, các phân tử protein trong mơi trƣờng có SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sê di chuyển về cực dƣơng trong điện trƣờng với tốc độ phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của chúng.
Tiến hành:
Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dƣới là gel tách đƣợc đổ cách mặt
trên 1,5 cm, để đơng hồn tồn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cơ phía trên, cài lƣợc để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đơng hồn tồn và ổn định. Thành phần gel nhƣ bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5%
STT Thành phần Gel tách (ml) Gel cô(ml)
1 H20 khử trùng 1,94 1,18 2 Dung dịch A 1,5 3 Dung dịch B 0,5 4 Dung dịch C 2,5 0,3 5 Dung dịch D 0,06 0,02 6 APS 0,024 0,01 7 TEDMED 0,005 3,5
Biến tính mẫu: Mẫu protein đƣợc bổ sung đệm xử lý mẫu dye 6x với tỷ lệ
Điện di: Bản gel đƣợc lắp vào hệ thống điện di và chạy với cƣờng độ dịng
điện là 20 mA cho lớp gel cơ và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút. Sau điện di, bản gel đƣợc tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 1- 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy, hoặc nhuộm với 0,1% (w/v) AgNO3 theo quy trình của Bassam và cộng sự (1991) có biến đổi [10] nhƣ sau: Ng m bản gel trong dung dịch A1, lắc nhẹ 20 phút để cố định bản gel. Lắc tiếp với dung dịch A2 trong 10 phút. Rửa với H2O cất bằng cách lắc nhẹ trong 10 phút. Chuyển bản gel vào dung dịch A3, lắc nhẹ trong 1 phút, sau đó rửa sạch bản gel 3 lần với H20 cất trong 1 phút. Nhuộm bản gel với dung dịch A4 trong tối 30 phút. Rửa bản gel 3 lần với H20 cất trong 1 phút. Hiện màu bản gel với dung dịch A5, lắc nhẹ nhàng cho đến khi băng xuất hiện. Dừng phản ứng hiện màu với dung dịch A6. Rửa bản gel với nƣớc cất, quan sát kết quả bằng mắt thƣờng.
2.2.18. Nhận dạng protein ngoại lai bằng kĩ thuật MALDI- TOF (MS/ MS) (Matrix-assisted laser desorption ionization- Time of flight)
Khối phổ là kỹ thuật ph n tích đo phổ về khối lƣợng của các ph n tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trƣờng. Mẫu đƣợc ion hóa trở thành các ph n tử tích điện khác nhau và đƣợc ph n tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. D liệu phổ khối đƣợc tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các cơng cụ tin sinh học. Có 2 loại nguồn ion hóa mẫu hay đƣợc sử dụng đó là nguồn MALDI và ESI. MALDI là thuật ng chỉ phƣơng pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lƣợng laser (Matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI). Nguồn MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dƣới tác dụng của năng lƣợng laser lớn.
2.2.19. Giải trình tự nucleotide
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, ph n đoạn chèn đƣợc giải trình tự theo nguyên lý của Sanger (1977) dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào mạch đơn đang tổng hợp vào đầu 3’- OH, khi gặp
dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang khơng có nhóm 3’- OH, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Nồng độ mỗi dideoxynucleotide đƣợc xác định thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và khơng gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khn. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide [53]
2.2.20. Xử lý số liệu
Phần mềm Microsoft Excel đƣợc sử dụng để xử lý số liệu thu đƣợc trong q trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số thống kê.
Chƣơng trình Edit-SeqDNAStar và BioEdit- Seq đƣợc dùng để phân tích, so sánh trình tự nucleotide và amino acid tƣơng ứng.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NHÂN DỊNG GEN MÃ HĨA LUMBROKINASE 3.1. NHÂN DỊNG GEN MÃ HĨA LUMBROKINASE
3.1.1. Thiết kế vector tách dòng pJET1.2 blunt/lk (pJLK)
Tiến hành khuếch đại đoạn gen lk đã đƣợc tối ƣu codon trong vector pUC57 nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu pPLKF- pPLKR. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose, nhuộm với ethidium bromide và quan sát dƣới tia cực tím ở bƣớc sóng 245 nm. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm PCR (M: marker; 1, 2: gen lk
kích thƣớc 850 bp)
Kết quả điện di đồ cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc 1 băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 850 bp, đúng với kích thƣớc gen lk đã tối ƣu. Các băng sáng, rõ nét, không xuất hiện băng phụ. Điều này chứng tỏ không xảy ra hiện tƣợng bắt cặp không đặc hiệu. Sản phẩm PCR đủ điều kiện để tiến hành các bƣớc phân tích tiếp theo.
Tiếp đó, gen lk đƣợc nối vào vector pJET1.2 blunting nhờ enzyme T4 ligase
tạo vector tách dòng pJet1.2 blunting/lk . Dịch lai đƣợc biến nạp vào E.coli DH10B bằng sốc nhiệt. Sau khi đƣợc biến nạp, dịch nuôi đƣợc lắc phục hồi rồi trải trên đĩa thạch LB bổ sung 100 μg/ml ampicillin, ủ 370C qua đêm. Các khuẩn lạc riêng rẽ
1000→ 750→ 500→
đƣợc chọn nuôi trong LB lỏng bổ sung 0,1% ampicillin, lắc ở 37oC qua đêm, tách plasmid và điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Plasmid mang đoạn chèn có kích thƣớc lớn hơn sẽ nằm cao hơn so với plasmid không mang đoạn chèn.
A B
Hình 3.2. Điện di đồ (A) sản phẩm tách plasmid pJLK (2, 5, 6: Plasmid
pJLK; 1, 3, 4: plasmid pJET1.2); (B) sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pJLK với XbaI và XhoI (1: Plasmid pJLK; M: marker)
Kết quả điện di đồ theo hình 3.2A cho thấy plasmid ở các giếng số 2, 5, 6 có kích thƣớc lớn hơn so với plasmid ở giếng số 1, 3, 4 trên cùng 1 bản gel điện di. Theo lý thuyết pJET1.2 chỉ có thể tồn tại đƣợc khi chúng mang các đoạn chèn làm phá vỡ cấu trúc gen gây chết. Trong thực nghiệm vẫn xảy ra trƣờng hợp các đoạn gen gãy có kích thƣớc nhỏ gắn vào vector pJET1.2, tạo các dịng plasmid có kích thƣớc nhỏ gần bằng pJET1.2 nên khơng phát hiện đƣợc khi điện di trên gel. Nhƣ vậy, các plasmid ở giếng số 2, 5, 6 có khả năng chứa gen lk. Các plasmid này đƣợc cắt bằng 2 enzyme giới hạn XbaI và XhoI để kiểm tra sự có mặt của gen lk.
Kết quả điện di đồ kiểm tra sản phâm cắt plasmid pJLK theo hình 3.2B cho thấy xuất hiện 2 băng có kích thƣớc khoảng 2900 bp và 850 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pJET1.2 blunt và gen lk. Vector này đƣợc giải trình tự để khẳng
1 2 3 4 5 6 1 M bp ←3000 ←1000 ←750
định sự có mặt của gen lk. Sử dụng 2 phần mềm Edit-SeqDNAStar và BioEdit-Seq phân tích trình tự thu đƣợc, kết quả cho thấy đã thiết kế thành cơng vector tách dịng pJLK chứa đoạn gen chèn lk có trình tự đúng theo thiết kế (Hình 3.3).
Hình 3.3. Trình tự vector tách dịng pJLK (màu xanh: trình tự mồi pPLKF và
3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/LK (pPLK)
Vector pPICZαA đƣợc sử dụng để biểu hiện gen lk có một số đặc điểm: có
kích thƣớc 3593 bp; trình tự khởi đầu sao chép để có thể tự sao chép trong tế bào E.
coli, có trình tự nh n dịng đa điểm cắt với một điểm cắt duy nhất của hai enzyme EcoRI và XbaI; mang gen chọn lọc kháng zeocine; chứa promoter AOXI cho phép
biểu hiện trong nấm men P. pastoris.
Để thiết kế plasmid pPLK, đoạn gen lk đƣợc cắt từ plasmid pJLK bằng hai enzyme hạn chế EcoRI và XbaI, sẽ đƣợc ghép nối vào plasmid pPICZαA đã mở
vòng bởi cùng hai enzyme trên.
Sản phẩm gen lk và plasmid mở vòng pPICZαA đƣợc tinh sạch bằng Qiagen Extraction kit và đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Kết quả điện di đồ cho thấy 1 băng có kích thƣớc ~ 2900 bp (vector pPICZαA) và 1 băng có kích thƣớc ~850 bp (gen lk) (Hình 3.4A). Các băng thu đƣợc đều sạch, rõ nét và đúng kích
thƣớc, đủ điều kiện để sử dụng cho nh ng nghiên cứu tiếp theo.
Sau đó, các sản phẩm tinh sạch trên đƣợc nối với nhau bằng enzyme nối T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp pPLK. Dịch lai đƣợc biến nạp vào E.coli DH10B bằng sốc nhiệt. Sau biến nạp, dịch đƣợc lắc phục hồi 1 giờ, 37oC và trải trên đĩa thạch LB có bổ sung zeocin, ủ 37oC qua đêm. Các khuẩn lạc riêng rẽ đƣợc chọn lựa, nuôi lắc trong môi trƣờng LB lỏng, bổ sung zeocin ở 37oC, qua đêm, tách plasmid và điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose và quan sát kết quả dƣới bƣớc sóng 245 nm.
Kết quả điện di đồ cho thấy, các plasmid mang đoạn chèn sẽ có kích thƣớc lớn hơn, nằm cao hơn so với các plasmid không mang đoạn chèn trên cùng 1 bản gel điện di. Dựa vào điện di đồ hình 3.4B, plasmid ở giếng số 4 có kích thƣớc cao hơn so với plasmid ở các giếng 1, 2, 3 và 5. Nhƣ vậy, plasmid này có thể mang đoạn gen lk nhƣ mong muốn.
Để kiểm tra sự có mặt của gen lk, các dịng plasmid tái tổ hợp pPLK đƣợc
chọn lựa có khả năng mang gen chèn đƣợc cắt với 2 enzyme EcoRI và XbaI. Sản
phẩm cắt đƣợc ủ ở 37oC trong 3 giờ, điện di trên gel 0,8%, nhuộm EtBr và kiểm tra kết quả dƣới bƣớc sóng 245 nm.
Kết quả sau điện di trên gel agarose cho thấy xuất hiện 2 băng là pPICZα ( ~ 3600 bp) và gen lk (~850 bp). Kích thƣớc này hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết (Hình 3.4C).
A B
C
Hình 3.4. Điện di đồ (A) sản phẩm tinh sạch vector pPICZαA và gen lk (M:
marker; 1: vector pPICZαA/ EcoRI+XbaI; 2: gen lk); (B) sản phẩm tách
plasmid pPLK (1, 3: plasmid pPICZαA; 2: plasmid pPLK); (C) sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme EcoRI và XbaI (1: plasmid pPLK/ EcoRI+XbaI; M:
marker)
Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thiết kế đƣợc vector biểu hiện pPLK. Để khẳng định chính xác kết quả trình tự gen chèn, cấu trúc biểu hiện của vector pPLK, plasmid pPLK đƣợc tinh sạch theo kit của Bioneer (Hàn Quốc) và giải trình tự trƣớc khi sử dụng cho nh ng nghiên cứu tiếp theo.
Các vector pPLK đƣợc giải trình tự, sử dụng phần mềm Edit-Seq DNAStar và BioEdit- Seq để kiểm tra chính xác trình tự, cấu trúc biểu hiện trƣớc khi biến nạp và biểu hiện ở P. pastoris X33.
M 1 2 1 2 3 1 M
←3000
←1000 ←750
Hình 3.5. Trình tự vector biểu hiện pPLKvà trình tự amino acid tƣơng ứng
(Màu xanh: trình tự mồi pPLKF và pPLKR; màu đỏ: trình tự gen lk và aa tƣơng ứng)
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy cấu trúc vector biểu hiện đúng khung đọc, gen
lk đƣợc chèn vào đúng vị trí mong muốn, trình tự gen giống hồn tồn với trình tự