kích thƣớc 850 bp)
Kết quả điện di đồ cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc 1 băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 850 bp, đúng với kích thƣớc gen lk đã tối ƣu. Các băng sáng, rõ nét, không xuất hiện băng phụ. Điều này chứng tỏ không xảy ra hiện tƣợng bắt cặp không đặc hiệu. Sản phẩm PCR đủ điều kiện để tiến hành các bƣớc phân tích tiếp theo.
Tiếp đó, gen lk đƣợc nối vào vector pJET1.2 blunting nhờ enzyme T4 ligase
tạo vector tách dòng pJet1.2 blunting/lk . Dịch lai đƣợc biến nạp vào E.coli DH10B bằng sốc nhiệt. Sau khi đƣợc biến nạp, dịch nuôi đƣợc lắc phục hồi rồi trải trên đĩa thạch LB bổ sung 100 μg/ml ampicillin, ủ 370C qua đêm. Các khuẩn lạc riêng rẽ
1000→ 750→ 500→
đƣợc chọn nuôi trong LB lỏng bổ sung 0,1% ampicillin, lắc ở 37oC qua đêm, tách plasmid và điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Plasmid mang đoạn chèn có kích thƣớc lớn hơn sẽ nằm cao hơn so với plasmid không mang đoạn chèn.
A B
Hình 3.2. Điện di đồ (A) sản phẩm tách plasmid pJLK (2, 5, 6: Plasmid
pJLK; 1, 3, 4: plasmid pJET1.2); (B) sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pJLK với XbaI và XhoI (1: Plasmid pJLK; M: marker)
Kết quả điện di đồ theo hình 3.2A cho thấy plasmid ở các giếng số 2, 5, 6 có kích thƣớc lớn hơn so với plasmid ở giếng số 1, 3, 4 trên cùng 1 bản gel điện di. Theo lý thuyết pJET1.2 chỉ có thể tồn tại đƣợc khi chúng mang các đoạn chèn làm phá vỡ cấu trúc gen gây chết. Trong thực nghiệm vẫn xảy ra trƣờng hợp các đoạn gen gãy có kích thƣớc nhỏ gắn vào vector pJET1.2, tạo các dịng plasmid có kích thƣớc nhỏ gần bằng pJET1.2 nên không phát hiện đƣợc khi điện di trên gel. Nhƣ vậy, các plasmid ở giếng số 2, 5, 6 có khả năng chứa gen lk. Các plasmid này đƣợc cắt bằng 2 enzyme giới hạn XbaI và XhoI để kiểm tra sự có mặt của gen lk.
Kết quả điện di đồ kiểm tra sản phâm cắt plasmid pJLK theo hình 3.2B cho thấy xuất hiện 2 băng có kích thƣớc khoảng 2900 bp và 850 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pJET1.2 blunt và gen lk. Vector này đƣợc giải trình tự để khẳng
1 2 3 4 5 6 1 M bp ←3000 ←1000 ←750
định sự có mặt của gen lk. Sử dụng 2 phần mềm Edit-SeqDNAStar và BioEdit-Seq phân tích trình tự thu đƣợc, kết quả cho thấy đã thiết kế thành cơng vector tách dịng pJLK chứa đoạn gen chèn lk có trình tự đúng theo thiết kế (Hình 3.3).
Hình 3.3. Trình tự vector tách dịng pJLK (màu xanh: trình tự mồi pPLKF và
3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/LK (pPLK)
Vector pPICZαA đƣợc sử dụng để biểu hiện gen lk có một số đặc điểm: có
kích thƣớc 3593 bp; trình tự khởi đầu sao chép để có thể tự sao chép trong tế bào E.
coli, có trình tự nh n dịng đa điểm cắt với một điểm cắt duy nhất của hai enzyme EcoRI và XbaI; mang gen chọn lọc kháng zeocine; chứa promoter AOXI cho phép
biểu hiện trong nấm men P. pastoris.
Để thiết kế plasmid pPLK, đoạn gen lk đƣợc cắt từ plasmid pJLK bằng hai enzyme hạn chế EcoRI và XbaI, sẽ đƣợc ghép nối vào plasmid pPICZαA đã mở
vòng bởi cùng hai enzyme trên.
Sản phẩm gen lk và plasmid mở vòng pPICZαA đƣợc tinh sạch bằng Qiagen Extraction kit và đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Kết quả điện di đồ cho thấy 1 băng có kích thƣớc ~ 2900 bp (vector pPICZαA) và 1 băng có kích thƣớc ~850 bp (gen lk) (Hình 3.4A). Các băng thu đƣợc đều sạch, rõ nét và đúng kích
thƣớc, đủ điều kiện để sử dụng cho nh ng nghiên cứu tiếp theo.
Sau đó, các sản phẩm tinh sạch trên đƣợc nối với nhau bằng enzyme nối T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp pPLK. Dịch lai đƣợc biến nạp vào E.coli DH10B bằng sốc nhiệt. Sau biến nạp, dịch đƣợc lắc phục hồi 1 giờ, 37oC và trải trên đĩa thạch LB có bổ sung zeocin, ủ 37oC qua đêm. Các khuẩn lạc riêng rẽ đƣợc chọn lựa, nuôi lắc trong môi trƣờng LB lỏng, bổ sung zeocin ở 37oC, qua đêm, tách plasmid và điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose và quan sát kết quả dƣới bƣớc sóng 245 nm.
Kết quả điện di đồ cho thấy, các plasmid mang đoạn chèn sẽ có kích thƣớc lớn hơn, nằm cao hơn so với các plasmid không mang đoạn chèn trên cùng 1 bản gel điện di. Dựa vào điện di đồ hình 3.4B, plasmid ở giếng số 4 có kích thƣớc cao hơn so với plasmid ở các giếng 1, 2, 3 và 5. Nhƣ vậy, plasmid này có thể mang đoạn gen lk nhƣ mong muốn.
Để kiểm tra sự có mặt của gen lk, các dòng plasmid tái tổ hợp pPLK đƣợc
chọn lựa có khả năng mang gen chèn đƣợc cắt với 2 enzyme EcoRI và XbaI. Sản
phẩm cắt đƣợc ủ ở 37oC trong 3 giờ, điện di trên gel 0,8%, nhuộm EtBr và kiểm tra kết quả dƣới bƣớc sóng 245 nm.
Kết quả sau điện di trên gel agarose cho thấy xuất hiện 2 băng là pPICZα ( ~ 3600 bp) và gen lk (~850 bp). Kích thƣớc này hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết (Hình 3.4C).
A B
C
Hình 3.4. Điện di đồ (A) sản phẩm tinh sạch vector pPICZαA và gen lk (M:
marker; 1: vector pPICZαA/ EcoRI+XbaI; 2: gen lk); (B) sản phẩm tách
plasmid pPLK (1, 3: plasmid pPICZαA; 2: plasmid pPLK); (C) sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme EcoRI và XbaI (1: plasmid pPLK/ EcoRI+XbaI; M:
marker)
Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thiết kế đƣợc vector biểu hiện pPLK. Để khẳng định chính xác kết quả trình tự gen chèn, cấu trúc biểu hiện của vector pPLK, plasmid pPLK đƣợc tinh sạch theo kit của Bioneer (Hàn Quốc) và giải trình tự trƣớc khi sử dụng cho nh ng nghiên cứu tiếp theo.
Các vector pPLK đƣợc giải trình tự, sử dụng phần mềm Edit-Seq DNAStar và BioEdit- Seq để kiểm tra chính xác trình tự, cấu trúc biểu hiện trƣớc khi biến nạp và biểu hiện ở P. pastoris X33.
M 1 2 1 2 3 1 M
←3000
←1000 ←750
Hình 3.5. Trình tự vector biểu hiện pPLKvà trình tự amino acid tƣơng ứng
(Màu xanh: trình tự mồi pPLKF và pPLKR; màu đỏ: trình tự gen lk và aa tƣơng ứng)
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy cấu trúc vector biểu hiện đúng khung đọc, gen
lk đƣợc chèn vào đúng vị trí mong muốn, trình tự gen giống hồn tồn với trình tự
gen gốc ban đầu, trình tự mồi, vị trí cắt của enzyme giới hạn, trình tự nucleotide mã hóa cho đi His đầy đủ.
Nhƣ vậy, đã thiết kế thành công vector biểu hiện pPLK. Vector pPLK này đủ điều kiện để biến nạp và biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33.
3.2. BIỂU HIỆN LUMBROKINASE TRONG P. PASTORIS X33 3.2.1. Tạo chủng P. pastoris X33 mang gen lk 3.2.1. Tạo chủng P. pastoris X33 mang gen lk
Để biểu hiện rLK, plasmid tái tổ hợp pPLK đƣợc cắt mở vịng bằng enzyme
SacI, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến P. pastoris X33. Khi vào trong thế
bào, gen lk sẽ hội nhập vào genome của tế bào chủ nhờ qui tắc trao đổi chéo tại vùng AOX1, tạo ra chủng tái tổ hợp mang gen lk.
Các dòng plasmid pPICZαA và pPLK sau khi kiểm tra đƣợc cắt lƣợng lớn bằng enzyme SacI, sản phẩm cắt đƣợc tinh sạch qua cột Themor Scientific nhƣ đã
trình bày trong phần phƣơng pháp (mục 2.2.3.8). Sản phẩm sau tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8 % agarose và quan sát dƣới ánh sang tia tử ngoại bƣớc sóng 245 nm (Hình 3.6).
Hình 3.6. Điện di đồ tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme
SacI (1, 2, 3, 4, 5: Plasmid pPLK/SacI; M: marker)
Kết quả điện di đồ cho thấy, các giếng 1-5, khi đƣợc cắt bằng enzyme SacI, plasmid pPLK đƣợc cắt mở vịng thành đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 4500 bp,
1 2 3 4 5 M bp
←4000 ←2000 ←1000
đúng với kích thƣớc vector biểu hiện pPLK theo tính tốn lý thuyết. Các băng đều sạch và rõ nét, chứng tỏ vector pPLK cắt bằng SacI đã đƣợc tinh sạch thành công.
Plasmid pPLK sau tinh sạch đƣợc biến nạp bằng xung điện vào tế bào nấm men P. pastoris X33 với điều kiện 1,5 kV; 200 Ω. Tế bào nấm men sau khi biến nạp đƣợc cấy trải và chọn lọc trên mơi trƣờng YPDS có bổ sung kháng sinh 100 g/ml zeocin. Tế bào nào có khả năng biểu hiện gen kháng zeocin mới phát triển đƣợc trên đĩa thạch, cho khuẩn lạc tròn, màu trắng. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ đƣợc nhặt nuôi trong môi trƣờng YPD, nuôi lắc 200 rpm, 28oC, qua đêm, tách DNA để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen lk trong genome
nấm men. Sản phẩm DNA sau tách chiết đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose, nhuộm EtBr và quan sát kết quả dƣới ánh sáng tia tử ngoại bƣớc sóng 245nm.
A B
C
Hình 3.7. Điện di đồ (A) sản phẩm tách DNA nấm men (1-4) ;(B) sản phẩm PCR
bộ gen nấm men P. pastoris X33 với cặp mồi pPLKF-pPLKR (1: đối chứng âm; 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR; M: marker); (C) sản phẩm PCR bộ gen nấm men P. pastoris X33 với cặp mồi 5'AOX1-3'AOX1 (1: đối chứng âm; 2, 3, 4, 5: sản phẩm PCR; M: marker) 1 2 3 4 1 M 2 3 4 5 2000→ 1500→ 1000→ 1 M 2 3 4 5
Kết quả tách chiết DNA genome nấm men theo điện di đồ cho thấy, các băng DNA tách chiết đƣợc sạch, rõ ràng và không đứt gãy, đủ tiêu chuẩn để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR (Hình 3.7A).
Để xác định chính xác gen ngoại lai có đƣợc chèn vào genome nấm men cùng plasmid tái tổ hợp hay không, chúng tôi sử dụng DNA nấm men này để làm khn kiểm tra sự có mặt của gen lk trong genome nấm men bằng phản ứng PCR
với cặp mồi đặc hiệu pPLKF- pPLKR (bảng 2.5). Ngoài ra, genome nấm men còn đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn DNA nằm gi a 2 trình tự 5’AOX1 và 3’AOX1. Cặp mồi xuôi và ngƣợc sử dụng trong PCR đƣợc cung cấp bởi hãng NewEngland Biolabs có trình tự nhƣ sau: 5’AOX1- GACTGGTTCCAATTGACAAGC
3’AOX1- GCAAATGGCATTCTGACATCC
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose, nhuộm EtBr và quan sát kết quả dƣới ánh sáng tia tử ngoại bƣớc sóng 245nm.
Kết quả điện di đồ cho thấy, khi tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc 1 băng với kích thƣớc khoảng 850 bp, đúng với kích thƣớc gen lk (Hình 3.7B). Khi tiến hành PCR với cặp mồi AOX1, các giếng 2, 3, 4 thu đƣợc 2 băng với kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 2200 bp- kích thƣớc vùng AOX1 trên genome nấm men và khoảng 1400 bp- kích thƣớc gen lk đƣợc chèn vào vùng MCS gi a 2 trình tự mồi
xi (5’AOX1) và mồi ngƣợc (3’AOX1) trên vector pPICZαA (Hình 3.7C). Kết quả này đúng với tính tốn lý thuyết. Nhƣ vậy, có thể kết luận đoạn pPLK/SacI đã đƣợc chèn vào genome của nấm men P. pastoris X33, tạo thành công chủng tái tổ
hợp P. pastoris X33 mang gen lk (XpPLK).
3.2.2. Sàng lọc các dòng P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp
Để kiểm tra kết quả và mức độ biểu hiện rLK, 32 dịng tái tổ hợp có genome mang đoạn chèn (XpPLK) đƣợc ni biểu hiện trong môi trƣờng YP bổ sung 0,5% methanol sau mỗi 24 giờ. Sau 96 giờ cảm ứng, ly tâm thu dich nổi và thử hoạt tính thủy ph n trên đĩa fibrin, ủ đĩa 37oC trong 5 giờ và đo vịng hoạt tính.
Kết quả cho thấy 17 dịng biểu hiện có hoạt tính thủy phân fibrin là các dịng X1, X5, X6, X7, X8, X10, X16, X18, X19, X20, X22, X25, X26, X28, X29, X31,
X32. Khi nhỏ dịch nổi sau biểu hiện 96 giờ từ các dòng này, trên đĩa fibrin xuất hiện vòng trịn thủy phân trong suốt. Trong khi đó, mẫu Xp là dịch nổi biểu hiện của chủng P. pastoris X33/pPICZαA không chứa gen lk và các dịng khác khơng xuất
hiện hoạt tính. Trong các dịng có hoạt tính, dịng X29 có hoạt tính cao nhất đạt 2,47 U/mg (Hình 3.8). Dịng này đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.8. Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin của dịch nổi thu từ các dòng P. pastoris
X33/ pPLK tái tổ hợp
3.2.3. Biểu hiện P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp
Để kiểm tra chính xác hơn sự tổng hợp protein rLK, quan sát kích thƣớc và mức độ biểu hiện của protein rLK, mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch ni cấy các dịng có hoạt tính thủy ph n fibrin đƣợc tủa acetone, biến tính và chạy điện di trên gel polyacrylamide 12,5%. Sau điện di, bản gel đƣợc nhuộm bạc để quan sát kết quả.
Kết quả điện di đồ cho thấy, ở các giếng 3-7, xuất hiện băng kích thƣớc khoảng 47 kDa khá đậm, băng này không xuất hiện ở chủng P. pastoris/ pPICZαA. Nhƣ vậy, có thể kết luận đã biểu hiện đƣợc protein tái tổ hợp rLK trong nấm men P.
pastoris X33. Kích thƣớc protein biểu hiện đƣợc cao hơn so với tính tốn lý thuyết
Hình 3.9. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp (1: chủng P. pastoris X33/pPICZαA; 2-7: dịch nổi chủng P. pastoris X33/pPLK; M: marker)
3.2.4. Tối ƣu môi trƣờng biểu hiện
Bảng 3.1. Hoạt tính rLK ở các mơi trƣờng biểu hiện khác nhau
Mơi trƣờng OD (600 nm) Hoạt tính rLK (U/ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Hoạt tính rLK (U/mg) BMMY 9,755± 0,009 0,112 0,267 0,419± 0,121 MMY 9,575± 0,013 0,112 0,211 0,530± 0,155 MM 6,870± 0,013 0,101 0,178 0,567± 0,062 YPM 8,725± 0,017 0,311 0,259 1,200± 0,090 YPTM 9,325± 0,023 0,435 0,271 1,605± 0,049 YPTCM 9,640± 0,021 0,767 0,289 2,654± 0,071 1 2 3 4 5 6 7 M kDa ←66 ←45 ←35 ←25 ←18
Để khảo sát mức độ biểu hiện rLK trên các môi trƣờng khác nhau, chủng P.
pastoris tái tổ hợp đƣợc nuôi biểu hiện trong các mơi trƣờng khác nhau có cảm ứng
bằng 0,5 % methanol sau mỗi 24 giờ. Sau 96 giờ cảm ứng, dịch nổi đƣợc thu nhờ ly tâm 12000 vòng/phút, trong 5 phút. Kiểm tra hoạt tính thủy phân fibrin cho thấy mơi trƣờng YPTCM thích hợp nhất cho biểu hiện rLK (đạt 0,767 U/ml) (Bảng 3.1). Môi trƣờng này đƣợc bổ sung triton X100 là chất hoạt động bề mặt, casamino acid là các acid amin- sản phẩm thủy phân của casein. Hai thành phần này có thể làm tăng mức độ sinh trƣởng tế bào, từ đó làm tăng khả năng sinh tổng hợp rLK ở nấm men.
Hình 3.10. Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch tối ƣu
môi trƣờng biểu hiện (1: chủng P. pastoris X33/pPICZαA; 2-7: dịch nổi chủng P. pastoris X33/pPLK trong các môi trƣờng BMMY, MMY, MM, YPM, YPTM, YPTCM; M: marker).
Kết quả này có sự khác biệt so với kết quả khảo sát điều kiện môi trƣờng biểu hiện rLK của Hu và cs (2005), các tác giả khi sử dụng 6 loại môi trƣờng tƣơng ứng cho kết quả biểu hiện ở mơi trƣờng YPM là cao nhất với hoạt tính dịch nổi đạt 2,5. 106 U/L sau 96 giờ nuôi cấy [29].
1 M 2 3 4 5 6 7 66→ 45→ 35→ 25→ 18→
Protein ngoại bào thu từ dịch nuôi cấy trên các môi trƣờng biểu hiện khác nhau đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12,5% và nhuộm bạc. Kết quả điện di đồ cho thấy, ở các môi trƣờng BMMY, YPM, YPTM và YPTCM đều xuất hiện băng protein kích thƣớc khoảng 47 kDa. Protein biểu hiện mạnh và cho băng điện di đậm nhất ở môi trƣờng YPTCM. Nhƣ vậy, môi trƣờng YPTCM đƣợc chúng tôi lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.5. Tối ƣu nồng độ methanol
Trong quá trình biểu hiện, methanol đƣợc bổ sung với vai trò cảm ứng promoter AOX1 kiểm sốt q trình sinh tổng hợp enzyme. Mức độ biểu hiện rLK khác nhau khi đƣợc cảm ứng methanol ở các nồng độ khác nhau. Khảo sát dải nồng độ methanol từ 0- 2%, nhận thấy, hoạt tính của rLK tăng dần và đạt cực đại khi cảm ứng 1% methanol (2,962 U/mg) sau mỗi 24 giờ. Hoạt tính cịn lại 81% ở 2% methanol (Hình 3.11).
A
B
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu hiện rLK (A) Hoạt
tính rLK () và động thái sinh trƣởng (Δ); (B) Điện di đồ protein ngoại bào (1-5: dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp sau tối ƣu nồng độ MeOH 0; 0,5; 1; 1,5; 2%); M: marker) ←66 ←45 ←35 ←25 1 2 3 4 5 M kDa
3.2.6. Tối ƣu thời gian biểu hiện
Dịch nuôi biểu hiện theo giờ đƣợc xác định sinh khối theo mật độ quang học tại bƣớc sóng 600 nm và xác định hoạt tính thủy ph n fibrin.
Kết quả hình 3.12 cho thấy, theo thời gian, sinh khối và biểu hiện của