CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS
1.4.1. Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris
Trong các hệ biểu hiện đƣợc sử dụng hiện nay, bao gồm: vi khuẩn E. coli, vi khuẩn Bacillus, tế bào động vật có vú, tế bào cơn trùng và nấm men P. pastoris, thì vi khuẩn E. coli đƣợc sử dụng nhiều nhất để sản xuất DNA và protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của hệ biểu hiện này là khơng có q trình sửa đổi sau dịch mã nhƣ quá trình glycosyl hóa, protein thƣờng cuộn xoắn lỗi, protein khơng bị glycosyl hóa nên khơng đảm bảo hoạt tính sinh học [17,44]. Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong E. coli thƣờng tồn tại ở dạng thể vùi, g y trở ngại cho việc tinh sạch, hoạt hóa khơi phục lại dạng có hoạt tính. Thời gian gần đ y, các nhà nghiên cứu sử dụng nấm men P. pastoris làm hệ vật chủ để biểu hiện protein ngoại bào, thuận tiện hơn trong q trình tinh sạch dạng có hoạt tính.
P. pastoris là một vi sinh vật nh n chuẩn nên các protein đƣợc biểu hiện ở tế
bào này thƣờng đƣợc glycosyl hóa và cuộn xoắn chính xác. Hơn n a, P. pastoris dễ ni cấy, có thể sinh trƣởng đến mật độ tế bào cao và các thao tác di truyền đơn giản hơn nhiều so với nuôi cấy các tế bào động vật [17,32]. Thêm vào đó, vector biểu hiện mang gen ngoại lai có thể đƣợc chèn hiệu quả vào genome nấm men thơng qua q trình tái tổ hợp gi a các đoạn tƣơng đồng tạo dòng tế bào ổn định dể sẵn sàng cho biểu hiện protein ngoại lai. Ƣu điểm n a là P. pastoris có 2 gen aox1 và aox2 (mã hóa cho enzyme alcohol oxidase- AOX) có promoter mạnh cho phép P. pastoris sử dụng methanol nhƣ một nguồn cacbon và nguồn năng lƣợng, tạo điều
kiện sản xuất một lƣợng lớn protein đích với kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp hơn hẳn so với các hệ thống biểu hiện nh n chuẩn khác. Cũng nhờ đó, P. pastoris dễ dàng
tăng trƣởng trong điều kiện môi trƣờng methanol khá cao, trong khi hầu hết các vi sinh vật khác sẽ chết trong điều kiện này. Các promoter AOX đƣợc cảm ứng bởi methanol và bị ức chế bởi glucose. Sự biểu hiện của protein ngoại lai đƣợc kiểm soát bởi promoter AOX1, đồng nghĩa với việc sự biểu hiện protein ngoại lai đƣợc cảm ứng bởi việc bổ sung methanol.
P. pastoris có 2 gen mã hóa AOX. Gen aox1 chịu trách nhiệm chính cho hoạt
tính AOX của tế bào [20,41,62]. Biểu hiện của gen aox1 đƣợc kiểm soát chặt chẽ và tăng nếu nồng độ methanol cao. Gen aox2 tƣơng đồng tới 97% với gen aox1, tuy nhiên lại có hoạt tính AOX thấp. Nếu P. pastoris bị đột biến gen aox1 (ví dụ, chủng
P. pastoris KM71), chỉ còn lại aox2, nên sẽ sinh trƣởng chậm trên mơi trƣờng có
methanol (Muts- Methanol utilization slow) [16,41]. Chủng này đƣợc sử dụng để biểu hiện các protein đòi hỏi sự cải biến s u sắc sau dịch mã. Chủng Mut+ (Methanol utilization plus) (ví dụ, chủng P. pastoris X33) là chủng dại có cả 2 gen
aox1 và aox2 nên sẽ sinh trƣởng tốt trên mơi trƣờng có methanol. Do đó, chủng P. pastoris X33 hay đƣợc sử dụng để biểu hiện protein ngoại lai, thu sản lƣợng protein
lớn [32].
P. pastoris (thuộc chi Komagataella) là 1 trong 10 loài nấm men khác nhau
đại diện cho 4 chi có khả năng chuyển hóa methanol. Các chi khác bao gồm
Candida, Hansenula và Torulopsis. Con đƣờng chuyển hóa methanol ở tất cả các
lồi nấm men là giống nhau . Trong q trình chuyển hóa methanol, bƣớc đầu tiên là q trình oxi hóa methanol thành formaldehyde, sử dụng oxy ph n tử nhờ enzyme alcohol oxidase. Phản ứng này tạo formaldehyde và hydrogen peroxide H2O2. Để tránh ngộ độc H2O2, q trình chuyển hóa methanol diễn ra trong peroxisome, đ y là nơi cô lập nh ng sản phẩm độc hại của tế bào. Sau đó, formaldehyde tạo ra đƣợc chuyển tới tế bào chất để tham gia các con đƣờng trao đổi chất khác. Q trình chuyển hóa methanol đƣợc miêu tả cụ thể hơn trong hình 1.6. AOX là một homo-octamer với mỗi tiểu đơn vị chứa 1 co-factor FAD liên kết khơng cộng hóa trị. Alcohol oxidase có ái lực thấp với O2 và P. pastoris bù lại bằng cách tạo ra một lƣợng lớn enzyme này.
Hình 1.6. Con đƣờng chuyển hóa methanol trong P. pastoris [32]
Ở chủng P. pastoris, các protein tiết thƣờng đƣợc điều khiển bởi tế bào vật chủ nhờ chuỗi trình tự tín hiệu, đƣợc xem nhƣ trình tự tiết nằm trên protein ngoại lai. Trong một số các trình tự tiết khác nhau thì trình tự α- factor nguồn gốc từ S.
cerevisiae đƣợc sử dụng khá rộng rãi và thành công hiện nay [54]. Do đó, các
vector biểu hiện sử dụng cho P. pastoris thƣờng mang trình tự tín hiệu này để giúp cho protein tái tổ hợp đƣợc tiết ra ngồi mơi trƣờng ni cấy.
Ở sinh vật nh n chuẩn, các protein thƣờng đƣợc biến đổi sau q trình dịch mã, điều này có liên quan mật thiết đến hoạt tính của các protein. Sự glycosyl hóa là sự biến đổi thơng dụng nhất trong các hệ thống sinh vật nh n chuẩn và nó cần thiết cho các chức năng của protein nhƣ sự nhận diện, sự truyền tín hiệu, sự tƣơng tác gi a các protein và tế bào. Đ y là quá trình gắn thêm gốc đƣờng vào ph n tử protein khơng cần khn mẫu theo 2 dạng là glycosyl hóa protein ở vị trí N (N- linked) và glycosyl hóa ở vị trí O (O- linked) [26]. Hai dạng glycosyl hóa này khác nhau khơng chỉ ở vị trí gắn vào của đƣờng mà còn ở loại đƣờng và số lƣợng đƣờng đƣợc
bổsung. .
Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là quá trình biến đổi sau dịch mã đƣợc bảo tồn ở nấm men và các eukaryote khác. Glycosyl hố ở vị trí N bắt đầu từ mạng lƣới nội chất (ER) với sự chuyển chuỗi oligosaccharide vào vị trí asparagine của một
protein. Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit amin là Asn-Xaa-Ser/Thr (trong đó, Xaa là aa bất kỳ ngoại trừ proline). Chuỗi oligosaccharide này chứa 3 ph n tử đƣờng glucose ở đuôi không khử của cấu trúc lõi Man9GlcNAc2 gắn vào protein và nó bị cắt bởi các enzyme glucosidase của lƣới nội chất và enzyme α-1,2 mannosidase và đi vào bộ máy golgi. Sự glycosyl hóa ở vị trí O là q trình tạo liên kết cộng hóa trị gi a một monosaccharide với axit amin Ser hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự cho thấy glycosyl hố ở vị trí O khơng quyết định sự gấp cuộn và tính tan của protein.
P. pastoris đang ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các
glycoprotein dƣợc phẩm bởi dễ thao tác, dễ sản xuất với quy mơ lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ sản xuất ngắn. Một ƣu điểm khác là ở Pichia, các protein tiết
khơng có liên kết α1- 3 với mannose, có q trình glycosyl hóa vào đầu N (8- 14 mannose vào mỗi chuỗi bên) nhƣng khơng bị glycosyl hóa q mức nhƣ ở S. cerevisiae (50- 150 mannose ở mỗi chuỗi bên), do đó, protein đƣợc sản xuất từ Pichia có cấu trúc bậc 4 ít bị sai lệch.
1.4.2. Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men
Quá trình chèn vector biểu hiện vào genome nấm men dựa trên nguyên tắc trao đổi đơn (single crossover) ở các trình tự tƣơng đồng. Vector pPICZα không chứa gen his4 nên việc chèn vector tái tổ hợp chỉ có thể xảy ra ở locus AOX1. Các vector biểu hiện trong P. pastoris thƣờng chứa một đoạn DNA của promoter có
chứa điểm cắt giới hạn đặc biệt, có tác dụng hƣớng vector đã mở vịng tích hợp vào genome (Hình 1.8).
Hình 1.7. Hiện tƣợng tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1
hoặc aox1::ARG4 của genome nấm men P. pastoris [32]
Đầu tiên, vector cần đƣợc mở vòng tại locus 5’ AOX1 bằng 1 trong 3 loại enzyme: SacI, PmeI hoặc BstXI [33]. Tiếp đó, vector đƣợc mở vòng này sẽ chèn
vào vùng 5’ AOX1 hoặc 5’ aox1 ở genome nấm men. Do đó, chủng biểu hiện đƣợc
sử dụng sẽ quyết định chủng tái tổ hợp cho phép chuyển hóa methanol mạnh (Mut+) hay yếu (MutS). Nếu sử dụng chủng biểu hiện P. pastoris Mut+ mà xảy ra
trao đổi kép sẽ thay thể hẳn vùng AOX1 trong genome nấm men thì chủng tái tổ hợp nhận đƣợc sẽ có kiểu hình MutS[32].