Hoạt tính giảm dần theo thời gian, ở pH 6, hoạt tính enzyme cịn lại 53% sau 60 phút ủ. Hoạt tính tƣơng đối cịn lại 64% ở pH 6,5 sau khi ủ 60 phút. Tại các pH 7- 7,5, enzyme rLK khá bền sau 60 phút ủ, hoạt tính cịn lại 80- 100%. Trong khi đó, tại pH 8, hoạt tính cịn lại 62% sau 60 phút ủ. Điều này chứng tỏ enzyme bền ở khoảng pH trung tính. Kết quả cho thấy enzyme rLK trong nghiên cứu kém bền hơn so với kết quả nghiên cứu của Hu và cs (2005) rằng rLK bền dƣới 60oC trong khoảng pH rộng là 2- 11 [29]. Theo nghiên cứu của Cho và cs (2004) thì LK tách chiết từ giun đất L. rubellus cũng bền ở khoảng pH 4-12 [12].
Kết quả có sự tƣơng đồng với nghiên cứu của L Thị Bích Thủy và cs (2006), enzyme tách chiết từ giun quế P. excavatus có hoạt tính mạnh nhất ở 50oC tại pH 7- 7,5 và giảm dần ngoài khoảng pH này. Khi ủ ở 60oC thì hoạt tính enzyme cịn lại ở pH 6- 8,5, ủ ở 80oC thì hoạt tính cịn lại 7% với pH trung tính và mất hồn tồn với các khoảng pH kiềm và axit [4].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Thiết kế thành công vector biểu hiện pPLK, đúng khung đọc, trình tự gen lk đúng theo thiết kế, đủ điều kiện để biến nạp và biểu hiện trong nấm men P.
pastoris X33.
2. Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rLK có hoạt tính thủy ph n fibrin đạt 2,47 U/mg. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp lumbrokinase với môi trƣờng YPTCM, 96 giờ nuôi cấy, cảm ứng 1% methanol sau mỗi 24 giờ cho hoạt tính enzyme cao nhất đạt 2,94 U/mg.
3. Tinh sạch đƣợc rLK qua cột resin có kích thƣớc 47 kDa, độ sạch đạt 1,22 lần và hiệu suất tinh sạch đạt 12,96%. Nhận dạng rLK bằng kĩ thuật Maldi- Tof (MS/ MS) khẳng định chính xác protein tinh sạch đƣợc chính là lumbrokinase. 4. Enzyme rLK bền với nhiệt độ 30- 40oC. Nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng enzyme là 37- 40oC. Enzyme hoạt động mạnh và bền ở pH trung tính.
Kiến nghị
1. X y dựng quy trình lên men sản xuất rLK lƣợng lớn từ chủng nấm men tái tổ hợp P. pastoris XpPLK .
2. Thử nghiệm, đánh giá chất lƣợng của chế phẩm rLK tinh sạch đƣợc, định hƣớng trong sản xuất thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm Thị Minh Đức (2007), Sinh lý học, NXB Y học, Hà Nội.
2. Nguyễn Thế Khánh và Phạm Tử Dƣơng (1997), “Xét nghiệm sử dụng trong l m sàng”, NXB Y học, Hà Nội.
3. Bùi Phƣơng Linh, Đỗ Thị Tuyên và Quyền Đình Thi (2013), “Nh n dịng và biểu hiện gen mã hóa LK từ giun đất L. rubellus ở E. coli. ”, Hội nghị khoa học CNSH Tồn quốc. Nxb Khoa học và Cơng nghệ, Hà Nội, tr. 128-132.
4. L Thị Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên và Nguyễn Thị Ngọc Dao (2006), “Tinh sạch và xác định một số tính chất của enzym thuỷ ph n fibrin đƣợc tách chiết từ loài trùn quế Perionyx excavatus”, Tạp chí Sinh học, 28 (3), tr. 77-82.
5. Lê Văn Triển (1995), Khu hệ giun đất miền Đông Bắc Việt Nam, Luận án
Tiến sĩ sinh học, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Hà Nội.
6. Phan Thị Bích Tr m, Dƣơng Thị Hƣơng Giang, Hà Thanh Toàn và Phạm Thị Ánh Hồng (2008), “Khảo sát đặc điểm các serine- protease từ trùng quế
Perionyx excavatus”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV. Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, tr. 123-127.
Tài liệu tiếng Anh
7. Ambrus, C.M., N. Back, and J.L. Ambrus (1962), “On the mechanism of thrombolysis by plasmin”, Circulation research, 10, pp. 161-165.
8. Andrianova, I.V., V.G. Ionova, et al. (2001), “Use of allikor for the normalization of fibrinolysis and hemostasis in patients with chronic cerebrovascular diseases”, Klinicheskaia meditsina, 79 (11), pp. 55-58.
9. Astrup, T. and S. Mullertz (1952), “The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity”, Archives of biochemistry and biophysics, 40 (2), pp. 346-351.
10. Bassam, B.J., G. Caetano-Anolles, and P.M. Gresshoff (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Analytical biochemistry,
196 (1), pp. 80-83.
11. Bradford, M.M. (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”,
Analytical biochemistry, 72, pp. 248-254.
12. Cho, I.H., E.S. Choi, H.G. Lim, and H.H. Lee (2004), “Purification and characterization of six fibrinolytic serine-proteases from earthworm Lumbricus rubellus”, Journal of biochemistry and molecular biology, 37 (2), pp. 199-205.
13. Choi, H.S. and Y.S. Sa (2001), “Fibrinolytic and antithrombotic protease from Spirodela polyrhiza”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 65 (4), pp. 781-786.
14. Coll-Sangrona, E. and C.L. Arocha-Pinango (1998), “Fibrinolytic action on fresh human clots of whole body extracts and two semipurified fractions from
Lonomia achelous caterpillar”, Brazilian journal of medical and biological research, 31 (6), pp. 779-784.
15. Craven, L.L. (1950), “Acetylsalicylic acid, possible preventive of coronary thrombosis”, Annals of western medicine and surgery, 4 (2), pp. 95.
16. Cregg, J.M., K.R. Madden, K.J. Barringer, G.P. Thill, and C.A. Stillman (1989), “Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris”, Molecular and cellular biology, 9 (3), pp. 1316-1323.
17. Daly, R. and M.T. Hearn (2005), “Expression of heterologous proteins in
Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production”, Journal of molecular recognition : JMR, 18 (2), pp. 119-138.
18. Dametto, M., A.P. David, et al. (2000), “Purification and characterization of a trypsin-like enzyme with fibrinolytic activity present in the abdomen of horn fly, Haematobia irritans irritans (Diptera: Muscidae)”, Journal of protein chemistry, 19
19. Dong, G.Q., X.L. Yuan, Y.J. Shan, Z.H. Zhao, J.P. Chen, and Y.W. Cong (2004), “Molecular cloning and characterization of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from earthworm Eisenia fetida”, Acta biochimica et biophysica Sinica, 36 (4), pp. 303-308.
20. Ellis, S.B., P.F. Brust, P.J. Koutz, A.F. Waters, M.M. Harpold, and T.R. Gingeras (1985), “Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris”, Molecular and cellular biology, 5 (5), pp.
1111-1121.
21. Fan, Q., C. Wu, L. Li, R. Fan, Q. Hou, and R. He (2001), “Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III-1 from Lumbricus rubellus”, Biochimica et biophysica acta, 1526 (3), pp. 286-292.
22. Francis, C.W. and V.J. Marder (1991), “Fibrinolytic therapy for venous thrombosis”, Progress in cardiovascular diseases, 34 (3), pp. 193-204.
23. Garcia Gomez, L.J. and F.J. Sanchez-Muniz (2000), “Review: cardiovascular effect of garlic (Allium sativum)”, Archivos latinoamericanos de nutricion, 50 (3), pp. 219-229.
24. Ge, T., S.H. Fu, et al. (2007), “High density fermentation and activity of a recombinant lumbrokinase (PI239) from Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 52 (1), pp. 1-7.
25. Ge, T., Z.J. Sun, S.H. Fu, and G.D. Liang (2005), “Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 42 (1), pp. 20-28.
26. Grinna, L.S. and J.F. Tschopp (1989), “Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast,
Pichia pastoris”, Yeast, 5 (2), pp. 107-115.
27. Heyman, S.N., Z. Hanna, et al. (2004), “The fibrinolytic system attenuates vascular tone: effects of tissue plasminogen activator (tPA) and aminocaproic acid on renal microcirculation”, British journal of pharmacology, 141 (6), pp. 971-978.
28. Hu, R., S. Zhang, H. Liang, N. Li, and C. Tu (2004), “Codon optimization, expression, and characterization of recombinant lumbrokinase in goat milk”,
Protein expression and purification, 37 (1), pp. 83-88.
29. Hu, Y., X.L. Meng, J.P. Xu, W. Lu, and J. Wang (2005), “Cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme PM(246) in Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 43 (1), pp. 18-25.
30. Hwang, C.M., D.I. Kim, et al. (2002), “In vivo evaluation of lumbrokinase, a fibrinolytic enzyme extracted from Lumbricus rubellus, in a prosthetic vascular
graft”, The Journal of cardiovascular surgery, 43 (6), pp. 891-894.
31. Ichinose, A., K. Takio, and K. Fujikawa (1986), “Localization of the binding site of tissue-type plasminogen activator to fibrin”, The Journal of clinical investigation, 78 (1), pp. 163-169.
32. Invitrogen, Pichia expression kit: A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris.
33. Invitrogen, pPICZα A, B and C Pichia expression vectors for selection on Zeocin and purification of secreted, recombinant proteins.
34. Irving Innerfield (1960), Enzyme in clinical medicine, McGraw- Hill, New
York.
35. Jin, L., H. Jin, G. Zhang, and G. Xu (2000), “Changes in coagulation and tissue plasminogen activator after the treatment of cerebral infarction with lumbrokinase”, Clinical hemorheology and microcirculation, 23 (2-4), pp. 213-218. 36. Kanai, T., N. Ueki, et al. (1997), “Recombinant thermostable cycloinulo- oligosaccharide fructanotransferase produced by Saccharomyces cerevisiae”, Applied and environmental microbiology, 63 (12), pp. 4956-4960.
37. Kim, C.H., H.I. Choi, and D.S. Lee (1993), “Purification and biochemical properties of an alkaline pullulanase from alkalophilic Bacillus sp. S-1”, Bioscience,
38. Kim, W., K. Choi, et al. (1996), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from
Chungkook-Jang”, Applied and environmental microbiology, 62 (7), pp. 2482-2488. 39. Kodama, S., M. Tsujimoto, N. Tsuruoka, T. Sugo, T. Endo, and A. Kobata (1993), “Role of sugar chains in the in-vitro activity of recombinant human interleukin 5”, European journal of biochemistry / FEBS, 211 (3), pp. 903-908. 40. Kotb, E. (2014), “The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombin”, Biotechnology progress.
41. Koutz, P., G.R. Davis, C. Stillman, K. Barringer, J. Cregg, and G. Thill (1989), “Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes”, Yeast, 5 (3), pp. 167-177.
42. Kunamneni, A., T.T. Abdelghani, and P. Ellaiah (2007), “Streptokinase-the drug of choice for thrombolytic therapy”, Journal of thrombosis and thrombolysis, 23 (1), pp. 9-23.
43. Laemmli, U.K. (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227 (5259), pp. 680-685.
44. Lee, S.G., H.Y. Koh, et al. (2010), “Expression of recombinant endochitinase from the Antarctic bacterium, Sanguibacter antarcticus KOPRI 21702 in Pichia pastoris by codon optimization”, Protein expression and purification, 71 (1), pp.
108-114.
45. Liu, X.H. and F. Ge (2002), “Factors influencing the activity of fibrinolytic enzymes from earthworm, Eisenia fetida”, Zhongguo Zhong yao za zhi, 27 (6), pp.
423-426.
46. Mahendra Kumar Verma and K. Pulicherla (2011), “Lumbrokinase - A potent and stable fibrin- specific plasminogen activator ”, International Journal of Bioscience and Biotechnology, 3 (2), pp. 57-70.
47. Mihara, H., H. Sumi, et al. (1991), “A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus”, The Japanese journal of physiology, 41
48. Mousa, S.A. (2010), “Antithrombotic effects of naturally derived products on coagulation and platelet function”, Methods Mol Biol, 663, pp. 229-240.
49. Nakajima, N., K. Ishihara, M. Sugimoto, H. Sumi, K. Mikuni, and H. Hamada (1996), “Chemical modification of earthworm fibrinolytic enzyme with human serum albumin fragment and characterization of the protease as a therapeutic enzyme”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60 (2), pp. 293-300.
50. Nakajima, N., H. Mihara, and H. Sumi (1993), “Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57 (10), pp. 1726-1730.
51. Park, Y., E. Ryu, et al. (1999), “Characterization of antithrombotic activity of lumbrokinase-immobilized polyurethane valves in the total artificial heart”,
Artificial organs, 23 (2), pp. 210-214.
52. Resch, K.L. and E. Ernst (1995), “Garlic (Allium sativum)-a potent medicinal plant”, Fortschritte der Medizin, 113 (20-21), pp. 311-315.
53. Sanger, F., G.M. Air, et al. (1977), “Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA”, Nature, 265 (5596), pp. 687-695.
54. Scorer, C.A., R.G. Buckholz, J.J. Clare, and M.A. Romanos (1993), “The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, Gene, 136 (1-2), pp. 111-119.
55. Sikri, N. and A. Bardia (2007), “A history of streptokinase use in acute myocardial infarction”, Texas Heart Institute journal, 34 (3), pp. 318-327.
56. Sumi, H., H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara, and H. Muraki (1987), “A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet”, Experientia, 43 (10), pp. 1110-1111. 57. Sumi, H., N. Nakajima, and H. Mihara (1993), “A very stable and potent fibrinolytic enzyme found in earthworm Lumbricus rubellus autolysate”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 106 (3), pp. 763-766.
58. Sun, H.L., J.D. Jiao, Z.W. Pan, D.L. Dong, and B.F. Yang (2006), “The cardioprotective effect and mechanism of lumbrokinase”, Yao xue xue bao, 41 (3),
pp. 247-251.
59. Tai, M.W. and B.V. Sweet (2006), “Nattokinase for prevention of thrombosis”, American journal of health-system pharmacy, 63 (12), pp. 1121-1123. 60. Tang, Y., T. Jiang, et al. (2003), “Multi-isomorphous replacement phasing of the earthworm fibrinolytic enzyme component A from Eisenia fetida”, Science in China. Series C, Life sciences / Chinese Academy of Sciences, 46 (3), pp. 263-272.
61. Terashima, M., A. Kubo, M. Suzawa, Y. Itoh, and S. Katoh (1994), “The roles of the N-linked carbohydrate chain of rice alpha-amylase in thermostability and enzyme kinetics”, European journal of biochemistry / FEBS, 226 (1), pp. 249- 254.
62. Tschopp, J.F., P.F. Brust, J.M. Cregg, C.A. Stillman, and T.R. Gingeras (1987), “Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris”, Nucleic acids research, 15 (9), pp. 3859-3876.
63. Wang, Q.Q., J.S. Chen, X.X. Liang, P.X. Qiu, Y.W. Wang, and G.M. Yan (2004), “Hemorrhagic activity and mechanism of FIIa, a fibrinolytic enzyme from
Agkistrodon acutus venom”, Acta pharmacologica Sinica, 25 (4), pp. 514-521.
64. Wolf, M. and K. Ransberger (1972), Enzyme therapy, Vantage Press., New
York.
65. Xu, Z.R., Y.M. Yang, Q.F. Gui, L.N. Zhang, and L. Hu (2010), “Expression, purification, and characterization of recombinant lumbrokinase PI239 in
Escherichia coli”, Protein expression and purification, 69 (2), pp. 198-203.
66. Yan, X.M., C.H. Kim, C.K. Lee, J.S. Shin, I.H. Cho, and U.D. Sohn (2010), “Intestinal absorption of fibrinolytic and proteolytic lumbrokinase extracted from earthworm, Eisenia andrei”, The Korean journal of physiology & pharmacology : official journal of the Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology, 14 (2), pp. 71-75.
67. Yuan, X., C. Cao, Y. Shan, Z. Zhao, J. Chen, and Y. Cong (2006), “Expression and characterization of earthworm Eisenia fetida lumbrokinase-3 in
Pichia pastoris”, Preparative biochemistry & biotechnology, 36 (3), pp. 273-279.
68. Zhao, M.M., M. Li, Z.L. Han, M. Wang, and L.X. Du (2006), “Cloning and expression of lumbrokinase gene in Pichia pastoris”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 46 (4), pp. 581-
PHỤ LỤC
Bảng P1. Tối ƣu nồng độ chất cảm ứng methanol
Nồng độ Methanol (%)
OD (600 nm) Hoạt tính riêng rLK (UI/mg)
Hoạt tính tƣơng đối (%) 0 0,525 ± 0,034 0 0 0,5 9,742 ± 0,073 2,548 ± 0,018 100 1 13,35 ± 0,015 2,962 ± 0,003 116 1,5 9,420 ± 0,014 2,847 ± 0,027 111 2 7,460 ± 0,054 2,066 ± 0,024 81
Bảng P2. Tối ƣu thời gian biểu hiện
Thời gian biểu hiện (giờ)
OD (600 nm) Hoạt tính riêng rLK (UI/mg)
Hoạt tính tƣơng đối (%) 0 0,56 ± 0,013 0 0 24 4,42 ± 0,023 0,372 ± 0,013 13 48 6,46 ± 0,006 0,747 ± 0,007 25 72 12,38 ± 0,027 1,605 ± 0,025 55 96 13,59 ± 0,017 2,940 ± 0,017 100 120 11,67 ± 0,035 2,460 ± 0,009 84 144 10,28 ± 0,043 1,033 ± 0,005 35
Bảng P3. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu của rLK
Nhiệt độ (0C)
Hoạt tính LK (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối (%) 20 0,234 2,040 57 25 0,247 2,148 60 30 0,354 3,078 86 37 0,412 3,580 100 40 0,412 3,580 100
45 0,370 3,222 90
50 0,337 2,936 82
55 0,337 2,936 82
60 0,296 2,577 72
Bảng P4. pH phản ứng tối ƣu của rLK
pH Hoạt tính LK (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối (%)
3 0,163 1,511 40 3,5 0,163 1,511 40 4 0,183 1,701 45 4,5 0,212 1,964 52 5 0,244 2,266 60 5,5 0,253 2,341 62 6 0,285 2,644 70 6,5 0,343 3,172 84 7 0,408 3,777 100 7,5 0,408 3,777 100 8 0,408 3,777 100 8,5 0,367 3,4 90 9 0,244 2,266 60 9,5 0,212 1,964 52 10 0,179 1,662 44 10,5 0,061 0,566 15 11 0,024 0,226 6
Bảng P5. Đặc điểm câu trúc và chức năng của pPICZαA
STT Thành phần cấu trúc Đặc điểm và Vai trò
01 Promoter 5’ AOX1 Kích thƣớc 942 bp, promoter đƣợc cảm ứng bởi MeOH cho phép biểu hiện ở mức cao gen ngoại lai
02 Trình tự tín hiệu tiết yếu tố α Cho phép tiết hiệu quả protein ngoại lai 03 Vị trí đa điểm ( MCS) Cho phép chèn gen lạ vào vector biểu hiện 04 c-myc epitope ( Glu- Gln- Lys-
Leu- Ile- Ser- Glu- Glu- Asp- Leu)
Cho phép phát hiện protein họp nhất tái tổ hợp với kháng thể kháng myc hay kháng thể kháng myc- HRP
05 Đuôi polyhistidine ( 6X) đầu C Cho phép tinh sạch protein hợp nhất tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực với các ion kim loại có ái lực cao với histidine
Cho phép phát hiện protein hợp nhất tái tổ hợp với kháng thể kháng his đầu C hay kháng thể kháng his đầu C- HRP