pastoris X33/ pPLK; 2: rLK tinh sạch; M: marker)
Kết quả trên điện di đồ cho thấy, dịch tinh sạch từ P. pastoris X33/pPLK cho 1 băng đậm duy nhất với kích thƣớc khoảng 47 kDa. Kích thƣớc này cao hơn so với tính tốn lý thuyết, do trong q trình cải biến hậu dịch mã ở nấm men, protein biểu hiện có thể bị glycosyl hóa nên gắn thêm các gốc đƣờng tại vị trí nhận biết Asn- Xaa- Ser/Ther. Sử dụng cơ sở d liệu NetNGlyc 1.0 cho kết quả dự đoán protein rLK bị glycosyl hóa (N- linked) tại vị trí aa 193 (trình tự NVTT) (Phụ lục). Theo kết quả nghiên cứu của Hu và cs (2005), khi tiến hành nhân dòng, biểu hiện đoạn gen từ L. rubellus (AY178854) có kích thƣớc 747 bp trong nấm men P. pastoris
X33, tinh sạch dịch nổi qua cột resin, thu đƣợc rLK kích thƣớc 38,61 kDa. Kích thƣớc này cũng cao hơn so với tính tốn lý thuyết và ngun nh n đƣợc giải thích cũng có thể do q trình glycosyl hóa hậu dịch mã [29].
45→ 35→ 25→ 18→ kDa M 1 2 45→ 35→ 25→ 18→
Bảng 3.2. Hiệu suất tinh sạch rLK Mẫu Protein Mẫu Protein tổng số (mg) Hoạt độ riêng (U/mg)
Tổng unit Độ sạch Hiệu suất (%) Dịch nổi 2,16 2,94 6,35 1 100 Dịch qua cột Dịch tinh sạch 1,79 0,23 0,53 3,58 0,94 0,82 1,22 12,96
Để xác định hiệu suất tinh sạch qua cột resin, hàm lƣợng protein trong các dịch mẫu theo các bƣớc tinh sạch đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford và xác đinh hoạt tính. Hiệu suất tinh sạch từ P. pastoris X33/pPLK đạt 12,96 % với độ
sạch 1,22 lần, hoạt tính riêng rLK đạt 3,58 U/mg.
Ngồi ra, chúng tơi sử dụng thêm phƣơng pháp Anson cải tiến, sử dụng cơ chất casein, đo hoạt tính protease của dịch nổi và các ph n đoạn tinh sạch để so sánh d liệu. Kết quả thu đƣợc tƣơng đƣơng với phƣơng pháp đo hoạt tính sử dụng cơ chất fibrin, hiệu suất tinh sạch từ P. pastoris X33/ pPLK đạt 14,4 % với độ sạch 1,37 lần, hoạt tính riêng rLK đạt 0,79 CU/mg.
Để xác định chính xác trình tự chuỗi polypeptide của protein rLK biểu hiện đƣợc. Sản phẩm rLK sau tinh sạch đƣợc phân tích bằng khối phổ Maldi- Tof (MS/MS) và nhận dạng bằng cách tra cơ sở d liệu trình tự protein, kết quả cho thấy protein rLK tinh sạch đƣợc xác định đúng là protein LK từ loài giun đất E. fetida đã đƣợc đăng kí trình tự trên Genbank với mã hiệu Q3HR18 (Phụ lục).
3.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA rLK
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK
Do enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa học, tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi nhiệt độ tăng trong một giới hạn nhất định, chƣa
ảnh hƣởng đến cấu trúc ph n tử enzyme. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính, dịch enzyme đƣợc nhỏ lên đĩa fibrin và ủ ở dải nhiệt độ từ 20- 60o
C. Kết quả hình 3.14 cho thấy, khi nhiệt độ tăng từ 20- 30oC thì hoạt tính enzyme tăng dần lên. Hoạt tính enzyme đạt cao nhất ở 37- 40oC (100%). Khi nhiệt độ tăng lên trên 40oC, hoạt tính enzyme giảm dần tới 60oC. So với hoạt tính ở nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính ở 60oC cịn lại 72% (Bảng P2).
Khi nhiệt độ tăng quá giới hạn, hoạt tính enzyme giảm. Ngun nh n có thể do khi nhiệt độ tăng cao làm đứt gãy một số liên kết yếu trong ph n tử protein, làm thay đổi cấu trúc ph n tử này, đặc biệt là cấu trúc trong trung t m hoạt động của enzyme, từ đó ảnh hƣởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme. Nhƣ vậy, nhiệt độ hoạt động tối ƣu của enzyme là 37-40oC. Hu và cs (2005) cho biết hoạt tính enzyme rLK biểu hiện ở P. pastoris X33 đạt cao nhất tại 55oC, trên 65oC thì enzyme mất hoạt tính hồn tồn [29]. Ngoài ra, khi so sánh với 6 ph n đoạn LK tinh sạch đƣợc từ giun đất Lumbricus rubellus, kết quả cho thấy, cả 6 iso-enzyme có hoạt tính thủy
ph n casein cao nhất ở 50oC, hoạt tính giảm cịn 80-91% ở 55oC, từ 60- 65oC, hoạt tính enzyme giảm mạnh từ 25-2% và mất hồn tồn hoạt tính ở 70o
C [12]. Nhƣ vậy, so với các kết quả trên, rLK trong nghiên cứu của chúng tơi có nhiệt độ hoạt động tối ƣu thấp hơn, tại 50o
- 55oC, hoạt tính enzyme giảm cịn 84%.
Kết quả nghiên cứu tƣơng tự với kết quả của L Thị Bích Thủy và cs (2006), khi nghiên cứu một số tính chất của enzyme thủy ph n fibrin tách chiết từ loài giun quế Perionyx excavatus cho thấy, nhiệt độ hoạt động tối ƣu của enzyme này là
35oC- 45oC. Nhiệt độ phản ứng tăng từ 20oC đến 35oC thì hoạt tính thủy ph n fibrin cũng tăng dần lên, hoạt tính enzyme đạt cao nhất ở 35o- 45oC (100%), tăng lên trên 45oC hoạt tính enzyme giảm dần xuống cho tới 65o