Ức chế Enzyme phiên mã ngược NRTIs Tương tự Pyrimedine Tương tự Thymidine (t-NRTI) Zidovudine (AZT) Stavudine (d4T) Tương tự Cytidine Lamivudine (3TC) Zalcitabine (ddC) Emtricitabine (FTC) Tương tự Purine Tương tự Guanosine Abacavir (ABC) Tương tự Adenosine Tenofovil disoproxil fumarate (TDF) Tương tự Inosine Didanosine (ddl) NNRTIs Efavirenz (EFV) Nevirapine (VNP) Delavirdine (DLV) Etravirine (ETR) Ức chế Protease Saquinavir (SQV) Ritonavir (RTV) Indinavir (IDV) Nelfinavir (NFV) Amprenavir (APV) Lopinavir (LPV) Atazanavir (ATV) Fosamprenavir (fAPV) Tipranavir (TPV) Darunavir (DRV) Ức chế hòa màng Enfuvirtide (ENF) Maraviroc TRENDs in Pharmacological Sciences Ức chế enzyme Integrase Raltegravir (RGV)
Thuốc kháng HIV (ARV) là thuốc kháng Retrovirus, tác động bằng cách ngăn chặn sự nhân lên của virus, nhờ tác động vào các khâu trong quá trình nhân lên và hình thành virus mới (hình 1.9). Thuốc kháng HIV bao gồm các thuốc ức chế enzyme phiên mã ngược, ức chế protease của virus, ức chế enzyme tích hợp integrase, ức chế hòa màng, thuốc đối kháng thụ thể CCR5 2,64].
Hiện nay tại Việt Nam, phác đồ điểu trị HIV tuân theo “Hướng dẫn quản lý, điều trị và chăm sóc HIV/AIDS” của Bộ y tế ban hành kèm theo Quyết định số 3047/QĐ-BYT ngày 22 tháng 7 năm 2015 [2].
Phác đồ điều trị bậc 1: Sử dụng khi bắt đầu điều trị thuốc kháng HIV * Người lớn và trẻ 10 tuổi: TDF + 3TC + EFV
Thuốc thay thế: Sử dụng AZT nếu có chống chỉ định với TDF. Sử dụng NVP nếu có chống chỉ định với EFV (do độc tính với thần kinh trung ương). FTC thay thế cho 3TC. Nếu dị ứng với EFV độ 3, độ 4 không nên thay bằng NVP. Trẻ ≥ 10 tuổi nhưng cân nặng < 35 kg sử dụng phác đồ cho trẻ 3-10 tuổi.
* Trẻ từ 3 đến 10 tuổi: ABC + 3TC + EFV
Thuốc thay thế: sử dụng AZT nếu có chống chỉ định với ABC. Sử dụng NVP nếu có chống chỉ định với EFV. FTC có thể dùng để thay thế cho 3TC. Nếu dị ứng với EFV độ 3, độ 4 không nên thay bằng NVP.
*Trẻ dưới 3 tuổi: ABC + 3TC + LPV/r
Thuốc thay thế: Sử dụng AZT nếu có chống chỉ định với ABC. Sử dụng NVP nếu có chống chỉ định với LPV/r.
Nếu thất bại điều trị với phác đồ bậc 1, sử dụng các phác đồ bậc 2, bậc 3 theo
1.5. Nghiên cứu về sự phục hồi miễn dịch sau điều trị ARV 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về sự phục hồi các tế bào miễn dịch sau điều trị ARV. Severe và cộng sự nghiên cứu 1004 bệnh nhân AIDS lần đầu tiên được sử dụng ARV tại Port-au-Prince, Haiti, trong đó có 94 trẻ em dưới 13 tuổi, cho thấy: trước điều trị lượng tế bào TCD4 ở nhóm thanh thiếu niên và người lớn trung bình là 131 tế bào/µl (55 - 211). Sau 1 năm điều trị lượng TCD4 tăng lên 161 tế bào/µl (77 - 251). Trong nhóm trẻ em, TCD4% tăng lên từ 13% lên 21% sau điều trị 6 tháng và 26% sau điều trị 12 tháng [56]. Manosuthi và cộng sự nghiên cứu mức độ an toàn và hiệu quả của thuốc stavudine, lamivudine và nevirapine ở 2 nhóm bệnh nhân HIV, nhóm A gồm 204 bệnh nhân có TCD4 < 50 tế bào/µl và một nhóm B gồm 84 bệnh nhân TCD4 > 50 tế bào/µl nhận thấy: nhóm A có lượng TCD4 trung bình trước điều trị là 6 tế bào/µl, sau thời gian điều trị 12, 24, 36 và 48 tuần, lượng TCD4 tăng tương ứng là 98, 142, 176 và 201 tế bào/µl. Nhóm B có lượng tế bào CD4 trung bình trước điều trị là 139 tế bào/µl, sau thời gian điều trị, lượng tế bào TCD4 tăng lên 247, 301, 336 và 367 tương ứng với thời gian điều trị 12, 24, 36, 48 tuần [42]. Corbeau và Reynes đã tổng hợp từ một số nghiên cứu về sự phục hồi tế bào TCD4 sau điều trị ARV của các tác giả khác cho thấy 6 tháng đầu sau điều trị, số lượng TCD4 tăng 20 - 30 tế bào/µl mỗi tháng, sau điều trị 6 tháng đến 2 năm TCD4 tăng 5 - 10 tế bào/µl mỗi tháng, từ năm thứ hai tới ít nhất 7 năm là 2 - 5 tế bào/µl mỗi tháng [20] . Nghiên cứu của Jimoh và Naidoo từ 354 bệnh nhân có số lượng CD4 < 50 tế bào/µl sau 3 năm điều trị ARV cũng cho thấy số lượng CD4 phục hồi rất tốt. Dữ liệu về các tế bào dưới nhóm Th1/Th2/Th17/Treg ở bệnh nhân HIV cịn ít. Nghiên cứu của Bi nhận thấy các tế bào dưới nhóm của TCD4 hồi phục tốt sau điều trị thuốc kháng HIV [18]. Hầu hết các bệnh nhân HIV cần được điều trị thuốc kháng HIV kéo dài, do thách thức lớn nhất trong điều trị là khả năng kìm hãm các hồ chứa virus xuất hiện ngày càng nhiều trong giai đoạn im lặng của bệnh. Theo nghiên cứu của tác giả Honeycutt đăng trên tạp chí Nature Medicine năm 2017, đại thực bào cũng là một
loại tế bào chứa virus HIV đáp ứng với điều trị ARV, tuy nhiên lại khơng triệt để. Nhóm nghiên cứu phát hiện một tỷ lệ cao đại thực bào nhiễm bệnh bám trụ lại cơ thể bất chấp điều trị. Dù khơng có tế bào T, HIV vẫn có thể tái phát bằng con đường đại thực bào. Điều này cho thấy điều trị HIV, nhắm mục tiêu chính vào tế bào T như hiện nay, vẫn để lại một lỗ hổng trong điều trị. Các chiến lược điều trị HIV hiện tại đều nhằm kìm hãm sự hoạt động của virus trong các hồ chứa virus. Do đó, hiểu biết về từng loại tế bào miễn dịch sẽ đem lại các dự đốn về hồ chứa virus, từ đó có thể phát triển các chiến lược điều trị tối ưu cho bệnh nhân HIV [30].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam đã có một số cơng trình nghiên cứu về tế bào miễn dịch trước và sau điều trị ARV ở bệnh nhân nhiễm HIV, hầu hết chỉ nghiên cứu được tế bào TCD4. Khổng Minh Quang năm 2011 đã thực hiện nghiên cứu “Đánh giá hiệu quả điều trị HIV ở bệnh nhân HIV-AIDS tại phòng khám ngoại trú Bệnh viện Nhiệt đới Trung Ương” cho thấy lượng tế bào TCD4 trước điều trị trung bình là 110 tế bào/µl và sau 6 tháng điều trị tăng lên trên 200 tế bào/µl. Sự thay đổi tế bào TCD4 cũng phù hợp với các cải thiện triệu chứng lâm sàng [8]. Nguyễn Hữu Trí nghiên cứu về hiệu quả của ARV cũng cho thấy số lượng tế bào TCD4 tăng từ 70 tế bào/µl trước điều trị lên 145 tế bào/µl sau 6 tháng điều trị ARV [10]. Nguyễn Trần Chính theo dõi sau 1 năm điều trị ARV, tế bào TCD4 tăng từ 143 tế bào/µl lên 241 tế bào/µl [4]. Đỗ Thị Nhàn và cộng sự nhận thấy tế bào TCD4 tăng dần theo thời gian điều trị tương ứng là 91, 137, 206, 242 tế bào/µl trước điều trị, sau điều trị 6 tháng, 12 tháng và 24 tháng [7]. Nguyễn Văn Kính và Trần Văn Sơn báo cáo sự phục hồi tế bào TCD4 tương ứng là 131 tế bào/µl trước điều trị, tăng lên tương ứng 189, 274, 395 tế bào/µl sau điều trị ARV 6 tháng, 12 tháng, 24 tháng [9].
Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu chi tiết nào về dưới nhóm của tế bào TCD4, sự hoạt hố của TCD8 và các tế bào trí nhớ miễn dịch trong HIV-AIDS và đáp ứng với điều trị ARV.
1.6. Phương pháp thăm dò tế bào miễn dịch bằng Flow cytometry
Phương pháp đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry - FCM) sử dụng trong các phòng xét nghiệm lâm sàng đã được phát triển mạnh mẽ trong 1 vài thập kỷ vừa qua. FCM xác định cùng lúc nhiều đặc tính của các tế bào đơn lẻ khi tế bào này đi qua dịng chảy chất lỏng. Tốc độ đo trung bình khoảng 500 - 4000 tế bào/giây. Sự tán xạ ánh sáng ở các góc độ khác nhau có thể phân biệt được sự khác biệt về kích thước và độ phức tạp nhân, đồng thời các kháng thể gắn huỳnh quang với các màu khác nhau sẽ được gắn đặc hiệu với các kháng nguyên trên màng tế bào giúp xác định các thành phần kháng nguyên trên màng tế bào. Cách tiếp cận này làm cho FCM trở thành một cơng cụ mạnh mẽ trong việc phân tích chi tiết các quần thể tế bào phức tạp trong một thời gian ngắn. Nhờ sự xác định được chính xác các kháng nguyên trên bề mặt tế bào mà FCM có thể giúp bác sĩ xét nghiệm phân biệt được từng loại tế bào và các dưới nhóm của chúng nhờ các hiểu biết về sự có mặt các kháng nguyên đặc trưng trên màng tế bào. So với các phương pháp xác định tế bào trước đây như phương pháp hình thái học, phương pháp hố mơ miễn dịch…FCM có nhiều ưu việt, có thể xét nghiệm trên một tổng thể số lượng tế bào lớn, và ít phụ thuộc vào chủ quan của người làm xét nghiệm, được sử dụng rộng rãi hiện nay [55].
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
Trẻ em được chuẩn đoán nhiễm HIV-1 bằng kỹ thuật PCR lứa tuổi từ 1 tháng đến 16 tuổi đến tư vấn tại phòng khám ngoại trú khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Nhi Trung Ương đang được điều trị bằng thuốc kháng HIV tại các thời điểm 24, 36, 48, 60 tháng.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Trẻ hoặc người bảo hộ của trẻ không đồng ý tham gia nghiên cứu. - Trẻ bỏ điều trị hoặc không tuân thủ điều trị.
- Trẻ dùng thêm thuốc tăng cường miễn dịch. - Trẻ suy dinh dưỡng.
- Trẻ bị bệnh lao. - Trẻ bị ung thư.
2.1.3. Cỡ mẫu nghiên cứu
71 trẻ nhiễm HIV-1 đã và đang được điều trị ARV tại mỗi thời điểm nghiên cứu: - Sau 24 tháng điều trị : 20 trẻ
- Sau 36 tháng điều trị: 11 trẻ - Sau 48 tháng điều trị: 17 trẻ - Sau 60 tháng điều trị: 23 trẻ
20 trẻ nhiễm HIV-1 chưa được điều trị thuốc kháng HIV. Nhóm đối chứng: 30 trẻ khỏe mạnh cùng độ tuổi.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng khám ngoại trú khoa Truyền nhiễm, Khoa Huyết học, Bệnh viện Nhi Trung Ương.
2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ 1 tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2017
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.4.2. Các chỉ số và biến số nghiên cứu
Ở mỗi giai đoạn điều trị, thu thập các biến nghiên cứu như sau: Số lượng tế bào TCD4, TCD8 và tỉ lệ % TCD4, TCD8
Số lượng tế bào Th1, Th2, Th17, Treg, MAIT Tỉ lệ Th1/TCD4, Th2/TCD4, Th17/TCD4
Tỉ lệ tế bào TCD8 hoạt hóa, tỉ lệ MAIT hoạt hóa
2.4.3. Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
2.4.3.1. Bệnh phẩm nghiên cứu
Bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là máu ngoại vi, toàn phần, lấy vào ống chống đơng EDTA, thể tích 1,5 - 2ml.
Thu thập mẫu tại thời điểm 24, 36, 48, 60 tháng sau khi điều trị ARV.
2.4.3.2. Hóa chất
- Hóa chất hãng BD Biosciences, Hoa Kỳ: FITC Mouse Anti Human CD127; PE Mouse Anti Human CD25; FITC Mouse Anti Human HLA-DR; PE Mouse Anti Human CD161; APC Mouse Anti Human CD3; APC Mouse Anti Human CD38; CD4 (Leu-3a) PERCP; APCcy7 Mouse Anti Human CD3; Pharm Lyse.
- Hóa chất hãng Biolegend, Hoa Kỳ: Alexa Flour 448 Anti Human CD31; PE Anti Human CD197 (CCR7); PERCP Anti Human CD8; PEcy7 Anti Human CD4; APCcy7 Anti Human CD45RA; APCcy7 Anti Human CD45RA; PEcy7 Anti Human CD196 (CCR6); APC Anti Human CD194 (CCR4); APCcy7 Anti Human CD183 (CXCR3); PEcy7 Anti Human TCR Vα7.2.
Saline) (Gibco, Hoa Kỳ); Dung dịch PFA (Paraformaldehyde) 4% trong PBS (Affymetrix, Hoa Kỳ).
2.4.3.3. Xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu và phân tích kết quả dựa theo phương pháp của tiến sĩ Xiuqiong Bi, khoa virus, trường đại học Kanazawa, Nhật Bản [18].
a/ Các bước thực hiện *Bước 1:
Lựa chọn 1 mẫu máu của trẻ khoẻ mạnh, tiến hành ủ tế bào với 1 màu đơn kháng thể đơn dịng để kiểm tra hoạt động bình thường của máy FCM và chất lượng của kháng thể.
Ống 1: không nhuộm với kháng thể Ống 2: nhuộm với 1µl CD31 Alexa 448 Ống 3: nhuộm với 10µl CD161PE Ống 4: nhuộm với 1µl CD8 PerCP Ống 5: nhuộm với 1µl CD4 PEcy7 Ống 6: nhuộm với 5µl CD3 APC Ống 7: nhuộm với 2µl CD3 APCcy7 *Bước 2:
Đối với mẫu bệnh nhân, tiến hành ủ tế bào máu của bệnh nhân với các kháng thể đơn dòng, gồm 3 ống, mỗi ống 6 kháng thể, để phân tích trên máy FCM 6 màu.
+ Ống 1: Xác định TCD4, TCD8, nhuộm tế bào với các kháng thể sau: 1µl CD31 Alexa488; 1µl CCR7 PE ; 1µl CD8 PerCP; 1µl CD4 PEcy7; 5 µl CD3 APC; 1µl CD45RA APCcy7.
+ Ống 2: Xác định Th1/Th2/Th17/Treg, nhuộm tế bào với các kháng thể sau: 5µl CD127 FITC; 5µl CD25 PE ; 5µl CD4 PerCP; 1µl CCR6 PEcy7; 1µl CCR4 APC; 2µl CXCR3 APCcy7.
+ Ống 3: Xác định tế bào MAIT, TCD8 hoạt hóa, nhuộm với các kháng thể sau: 10µl HLA-DR FITC; 10µl CD161 PE; 1µl CD8 PerCP; 1µl Va7.2 PEcy7; 10µl
b/ Quy trình nhuộm tế bào 50µl máu tồn phần
Thêm kháng thể vào ống, dùng pipet trộn đều, sau đó giữ ở 4C trong tối, 20 phút. Thêm 2ml Pharm lyse (dung dịch phá vỡ hồng cầu), trộn đều, để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Ly tâm 500g trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn. Thêm 1ml PBS, trộn đều.
Ly tâm 500g trong 5 phút, bỏ dịch nổi.
Thêm 0,5ml 1%PFA 0,5%FBS trong PBS, trộn đều. Hút sang ống Facs.
Phân tích trên máy tế bào dòng chảy Facs canto II. c/ Cơ sở kháng nguyên trên bề mặt tế bào
TCD4 CD45RA+CD3+CD4+ Th1 CD4+CCR4-CXCR3+CCR6- Th2 CD4+CCR4+CXCR3-CCR6- Th17 CD4+CCR4+CXCR3-CCR6+ Treg CD4+CD25+CD127- MAIT CD3+ CD8+ CD161+ TCRVα7.2+
MAIT hoạt hoá CD3+ CD8+ CD161+ TCRVα7.2+CD38+
TCD8 CD45RA+CD3+CD8+
TCD8 hoạt hoá CD38+ HLA-DR+CD8+
d/ Cách thức phân tích tế bào trên máy tế bào dịng chảy Ống 1: Xác định TCD4, TCD8
Ống 3: Xác định tế bào MAIT, TCD8 hoạt hố
2.5. Phân tích số liệu
- Tất cả các số liệu được nhập liệu vào Excel, sau đó được thống kê phân tích trên mềm SPSS 20.0.
- So sánh giá trị trung bình của các biến ở các giai đoạn điều trị, sử dụng thuật toán “One way ANOVA”.
2.6. Đạo đức nghiên cứu
Tất cả các bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều tự nguyện và được biết về quy trình nghiên cứu, thông qua phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu. Phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ được nhận từ bố mẹ hoặc người bảo trợ cho các bệnh nhi tham gia nghiên cứu sau khi họ được đọc và được các bác sỹ giải thích cho họ hiểu về nghiên cứu (do đối tượng của nghiên cứu này là trẻ nhỏ). Trong trường hợp cả bố và mẹ của
Tất cả các thông tin về thành viên tham gia nghiên cứu sẽ được giữ bí mật bởi nhóm nghiên cứu. Thông tin cá nhân của các thành viên tham gia nghiên cứu sẽ được quản lý và bảo vệ một cách nghiêm ngặt. Dữ liệu dùng cho nghiên cứu này sẽ được trình bày dưới dạng mã hóa. Các mẫu bệnh phẩm và dữ liệu cá nhân của đối tượng nghiên cứu sẽ được mã hóa bằng những con số định danh mới và bảng mật mã này sẽ được quản lý bằng mật khẩu.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phân bố tuổi, giới của đối tượng nghiên cứu
Trong nghiên cứu của chúng tôi, độ tuổi trung bình của trẻ em được điều trị ARV tại thời điểm nghiên cứu là 8,2 tuổi, trong đó tuổi nhỏ nhất là 2,7 tuổi, tuổi lớn nhất là 16 tuổi. Độ tuổi trung bình của trẻ em tại thời điểm bắt đầu điều trị là 4,7 tuổi (từ 0,7 đến 12,4 tuổi) (bảng 3.1). Độ tuổi bắt đầu điều trị ARV ở trẻ em trong nghiên cứu của chúng tôi sớm hơn độ tuổi điều trị trung bình ở trẻ em trong một nghiên cứu lớn tại Tây Phi, phân tích 4808 trẻ nhiễm HIV-1 khởi động điều trị ARV ở độ tuổi trung bình là 5,6 tuổi [22].
Bảng 3.1. Phân bổ tuổi giới của đối tượng nghiên cứu