2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.4.2. Các chỉ số và biến số nghiên cứu
Ở mỗi giai đoạn điều trị, thu thập các biến nghiên cứu như sau: Số lượng tế bào TCD4, TCD8 và tỉ lệ % TCD4, TCD8
Số lượng tế bào Th1, Th2, Th17, Treg, MAIT Tỉ lệ Th1/TCD4, Th2/TCD4, Th17/TCD4
Tỉ lệ tế bào TCD8 hoạt hóa, tỉ lệ MAIT hoạt hóa
2.4.3. Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
2.4.3.1. Bệnh phẩm nghiên cứu
Bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là máu ngoại vi, tồn phần, lấy vào ống chống đơng EDTA, thể tích 1,5 - 2ml.
Thu thập mẫu tại thời điểm 24, 36, 48, 60 tháng sau khi điều trị ARV.
2.4.3.2. Hóa chất
- Hóa chất hãng BD Biosciences, Hoa Kỳ: FITC Mouse Anti Human CD127; PE Mouse Anti Human CD25; FITC Mouse Anti Human HLA-DR; PE Mouse Anti Human CD161; APC Mouse Anti Human CD3; APC Mouse Anti Human CD38; CD4 (Leu-3a) PERCP; APCcy7 Mouse Anti Human CD3; Pharm Lyse.
- Hóa chất hãng Biolegend, Hoa Kỳ: Alexa Flour 448 Anti Human CD31; PE Anti Human CD197 (CCR7); PERCP Anti Human CD8; PEcy7 Anti Human CD4; APCcy7 Anti Human CD45RA; APCcy7 Anti Human CD45RA; PEcy7 Anti Human CD196 (CCR6); APC Anti Human CD194 (CCR4); APCcy7 Anti Human CD183 (CXCR3); PEcy7 Anti Human TCR Vα7.2.
Saline) (Gibco, Hoa Kỳ); Dung dịch PFA (Paraformaldehyde) 4% trong PBS (Affymetrix, Hoa Kỳ).
2.4.3.3. Xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu và phân tích kết quả dựa theo phương pháp của tiến sĩ Xiuqiong Bi, khoa virus, trường đại học Kanazawa, Nhật Bản [18].
a/ Các bước thực hiện *Bước 1:
Lựa chọn 1 mẫu máu của trẻ khoẻ mạnh, tiến hành ủ tế bào với 1 màu đơn kháng thể đơn dịng để kiểm tra hoạt động bình thường của máy FCM và chất lượng của kháng thể.
Ống 1: không nhuộm với kháng thể Ống 2: nhuộm với 1µl CD31 Alexa 448 Ống 3: nhuộm với 10µl CD161PE Ống 4: nhuộm với 1µl CD8 PerCP Ống 5: nhuộm với 1µl CD4 PEcy7 Ống 6: nhuộm với 5µl CD3 APC Ống 7: nhuộm với 2µl CD3 APCcy7 *Bước 2:
Đối với mẫu bệnh nhân, tiến hành ủ tế bào máu của bệnh nhân với các kháng thể đơn dòng, gồm 3 ống, mỗi ống 6 kháng thể, để phân tích trên máy FCM 6 màu.
+ Ống 1: Xác định TCD4, TCD8, nhuộm tế bào với các kháng thể sau: 1µl CD31 Alexa488; 1µl CCR7 PE ; 1µl CD8 PerCP; 1µl CD4 PEcy7; 5 µl CD3 APC; 1µl CD45RA APCcy7.
+ Ống 2: Xác định Th1/Th2/Th17/Treg, nhuộm tế bào với các kháng thể sau: 5µl CD127 FITC; 5µl CD25 PE ; 5µl CD4 PerCP; 1µl CCR6 PEcy7; 1µl CCR4 APC; 2µl CXCR3 APCcy7.
+ Ống 3: Xác định tế bào MAIT, TCD8 hoạt hóa, nhuộm với các kháng thể sau: 10µl HLA-DR FITC; 10µl CD161 PE; 1µl CD8 PerCP; 1µl Va7.2 PEcy7; 10µl
b/ Quy trình nhuộm tế bào 50µl máu tồn phần
Thêm kháng thể vào ống, dùng pipet trộn đều, sau đó giữ ở 4C trong tối, 20 phút. Thêm 2ml Pharm lyse (dung dịch phá vỡ hồng cầu), trộn đều, để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Ly tâm 500g trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn. Thêm 1ml PBS, trộn đều.
Ly tâm 500g trong 5 phút, bỏ dịch nổi.
Thêm 0,5ml 1%PFA 0,5%FBS trong PBS, trộn đều. Hút sang ống Facs.
Phân tích trên máy tế bào dòng chảy Facs canto II. c/ Cơ sở kháng nguyên trên bề mặt tế bào
TCD4 CD45RA+CD3+CD4+ Th1 CD4+CCR4-CXCR3+CCR6- Th2 CD4+CCR4+CXCR3-CCR6- Th17 CD4+CCR4+CXCR3-CCR6+ Treg CD4+CD25+CD127- MAIT CD3+ CD8+ CD161+ TCRVα7.2+
MAIT hoạt hoá CD3+ CD8+ CD161+ TCRVα7.2+CD38+
TCD8 CD45RA+CD3+CD8+
TCD8 hoạt hoá CD38+ HLA-DR+CD8+
d/ Cách thức phân tích tế bào trên máy tế bào dịng chảy Ống 1: Xác định TCD4, TCD8
Ống 3: Xác định tế bào MAIT, TCD8 hoạt hố
2.5. Phân tích số liệu
- Tất cả các số liệu được nhập liệu vào Excel, sau đó được thống kê phân tích trên mềm SPSS 20.0.
- So sánh giá trị trung bình của các biến ở các giai đoạn điều trị, sử dụng thuật toán “One way ANOVA”.