Phương pháp sắc ký bản mỏng

Chương 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng

Nguyên tắc: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là kỹ thuật

sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký bản mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn theo tỉ lệ thích hợp. Trong q trình di chuyển các chất trong mẫu thử được di chuyển qua lớp mỏng, theo chiều của pha động, tuy nhiên di chuyển với tốc độ khác nhau. Sau quá trình ta thu được một sắc ký đồ bản mỏng. Cơ chế của sự chia tách là hấp thụ, phân bố trao đổi ion, sàng lọc phân tử, hay sự phối hợp của nhiều cơ chế tùy vào tính chất của pha tĩnh và dung mơi của pha động.

Mục đích: Dựa vào sự phân tách khác nhau của các chất trên bản TLC, xác định

số lượng các hợp chất có trong dịch chiết. Đồng thời, định hướng xác định nhóm hợp chất dựa vào màu sắc quan sát được dưới bước sóng 365 nm, cũng như màu sắc các hợp chất khi sử dụng thuốc thử Vanillin và AlCl3,

Quy trình:

 Sử dụng ống mao quản, chuyển dịch chiết methanol lên bề mặt bản silica gel kích thước 36 cm. Cố định độ dài đường chạy trên bản silica gel là 4,5 cm.  Chuẩn bị 5 ml hỗn hợp dung mơi khai triển, ổn định trong bình khai triển trước

30 phút để đảm bảo bão hịa dung mơi. Hỗn hợp bao gồm ethyl acetate/axit acetic/ethanol với tỉ lệ 4/1/1,

 Đặt bản silica gel vào bình khai triển, đậy nắp, đợi đến khi dung mơi chạy hết độ dài đường chạy thì lấy bản silica gel ra, để khô.

 Quan sát các băng chất trên bản silica gel trong điều kiện thường, dưới bước sóng dài 365 nm, sau khi phun thuốc thử Vaniline và thuốc thử AlCl3.

Đánh giá kết quả: Xác định hệ số di chuyển - giá trị Rf của từng chất dựa vào tỉ lệ

độ dài đường chạy của chất với độ dài đường chạy của dung môi. Từ giá trị Rf xác định được, so sánh với giá trị Rf của các chất chuẩn Quercetin và Rutin.

Xác định nhóm chức có thể có trong các hợp chất dựa vào màu sắc khi quan sát được dưới các điều kiện: ánh sáng thường, bước sóng 365 nm, sau khi phun thuốc thử.