Chương 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.9. Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavi nT
Nguyên tắc: Thioflavin T (ThT) là một muối benzothiazole thu được bằng cách
methyl hóa ofehehrothiotoluidine với metanol khi có mặt của axit clohydric. ThT được sử dụng làm thuốc nhuộm để quan sát và định lượng sự hiện diện hoặc sự hình thành sợi của các protein tổng hợp, hoặc amyloid, cả in vitro và in vivo (ví dụ, mảng beta
amyloid tìm thấy trong não của bệnh nhân bệnh Alzheimer; trong não của bệnh nhân CGD). Xét nghiệm Thioflavin T (ThT) đo lường những thay đổi về cường độ ThT khi gắn với các sợi amyloid. Cơ chế tăng cường huỳnh quang khi liên kết với amylid là do sự cố định quay của liên kết C-C liên kết với vòng benzothiazole và aniline. ThT liên kết với các chuỗi dọc theo trục dài của bề mặt sợi amyloid. Sự tăng cường phát huỳnh quang có thể được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang hoặc bằng quang phổ huỳnh quang [13].
Mục đích: Đánh giá khả năng tạo sợi của peptide β-amyloid trong điều kiện thường và điều kiện với sự có mặt của các chất chuẩn Quercetin, Rutin và các hợp chất tinh sạch từ nụ hoa hịe khơ
Quy trình:
Chuẩn bị dung dịch stock ThT bằng cách thêm 8 mg ThT vào 10 ml phosphate buffer (10 mM phosphate, 150 mM NaCl, pH 7,0). Bảo quản dung dịch stock tránh ánh sáng, dung dịch này có thể ổn định trong 1 tuần.
Pha loãng dung dịch stock vào phosphate buffer (1ml dung dịch stock ThT với 49 ml dung dịch buffer) để tạo dung dịch làm việc (chỉ sử dụng trong ngày).
Đo mật độ huỳnh quang của dung dịch làm việc ở bước sóng kích thích 390 nm, bước sóng phát quang 535 nm
Đánh giá kết quả:
Sử dụng cơng thức đánh giá khả năng ngăn chặn sự tích tụ β-amyloid như sau: Sự ngăn chặn (%) = 100 – 100× S1−So
T1−To Trong đó:
S1: giá trị huỳnh quang của mẫu khi có mặt ThT
So: giá trị huỳnh quang của mẫu khi khơng có mặt ThT T1: giá trị huỳnh quang của đối chứng âm khi có mặt ThT
To: giá trị huỳnh quang của đối chứng âm khi khơng có mặt ThT