Phổ 1H-NMR của chất C2 cũng cho thấy sự xuất hiện của proton hydroxyl, proton nhân thơm và proton từ dung môi. Các giá trị phổ của chất C2 và chất chuẩn quercetin được so sánh trong bảng kết quả 3.4:
Bảng 3.4. Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2
1H NMR STT Quercetin_St C2 ppm 1 11,613 12,441 2 9,928 9,911 3 8,729 4 8,482 5 N/A 7,672
6 N/A 7,54 7 N/A 7,536 8 N/A 6,933 9 6,800~6,794 6,899 10 6,676 6,881 11 6,673~6,652 6,863 12 N/A 6,452 13 N/A 6,394 14 N/A 6,39 15 6,019~6,018 6,173 16 6,003~6,000 5,971 17 5,536~5,531 5,529 18 5,316~5,309 5,279 19 N/A 3,828 20 N/A 3,484 21 N/A 2,729 22 2,497 2,49 23 N/A 2,141 24 N/A 1,975 25 1,626 1,62 26 N/A 1,452 27 N/A 1,177 28 N/A 0,889 29 N/A 0,817
Chú thích: N/A là khơng tồn tại
Từ bảng so sánh 3.4 có thể thấy, các tín hiệu proton thu nhận được của chất C2 tương đồng với các tín hiệu đo được của quercetin chuẩn. Các tín hiệu chính thể hiện sự có mặt của các proton nhân thơm bao gồm tín hiệu 6,800~6,793 ppm đến 5,316- 5,309 đều quan sát được trong phổ đồ của chất C2. Ngồi ra, trong phổ đồ của chất C2
cịn xuất hiện một số tín hiệu nhiễu. Vì q trình tinh sạch chất trải qua nhiều bước, sử dụng nhiều hệ dung mơi khác nhau, nên các tín hiệu nhiễu trong phổ đồ có thể được giải thích là do các dung mơi chưa được loại bỏ hồn tồn khỏi chất tinh sạch.
Kết hợp các dữ liệu thu được bao gồm: giá trị Rf tương đồng với quercetin chuẩn, giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H tương đồng với chất quercetin. Chúng tôi dự kiến chất C2 là quercetin với công thức cấu tạo như sau:
Quercetin là một flavonoids phổ biến trong tự nhiên, thuộc nhóm polyphenols, có nhiều trong các loại rau, củ, quả. Đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc, đặc tính, cơng dụng và chức năng của quercetin. Thêm vào đó, Dasha cùng cộng sự đã xác định quercetin là một thành phần được tìm thấy trong cây Sophora japonica, đồng thời các nghiên cứu khác cũng chỉ ra sự xuất hiện của quercetin trong các họ thực vật khác nhau [15, 26]. Điều này củng cố thêm rằng chất C2 là quercetin và kết quả chúng tôi thu được là tương đồng với những nghiên cứu trước đây.
3.2.2. Xác định cấu trúc chất C6
Dựa trên các kết quả đã thu được bao gồm: giá trị Rf bằng với rutin chuẩn và sự tồn tại của khung flavonoids thông qua sự chỉ thị của thuốc thử vanillin và AlCl3, chúng tôi định hướng chất C6 có tính chất tương tự như rutin. Rutin là một flavonoids bao gồm 2 thành phần gốc quercetin flavonol và đường đôi rutinose. Đây là một hợp chất tự nhiên với cấu trúc tương đối phức tạp. Vì vậy, với mục tiêu xác định thành phần hóa
học và khối lượng của chất C6, chúng tôi kết hợp sử dụng 2 phương pháp đo phổ khối lượng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
3.2.2.1. Xác định phổ khối lượng chất C6
Phổ khối lượng với nguồn ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion (ESI- MS) được thực hiện trên thiết bị LTQ-Orbitrap XL. Kết quả phổ được thể hiện trong hình 3.8.
Hình 3.8. Phổ khối lượng ESI của chất C6
Chú thích: Các số ở trên mỗi đỉnh thể hiện giá trị m/z. Giá trị Z chỉ trạng thái tích điện của các tín hiệu
Trong phổi khối lượng này, giá trị m/z 610 đã được phát hiện. Ngoài ra, các đỉnh với giá trị m/z lớn hơn 610 cũng được phát hiện. Những đỉnh này được xác định là chất có giá trị m/z 610 được thêm một chất khác. Ví dụ, giá trị m/z 633 (lớn hơn m/z 610) là kết quả của sự hợp nhất giữa ion natri với hợp chất có giá trị m/z 610 vì khối lượng ion natri là 23, Các đỉnh khác dịch chuyển 74 Da so với các đỉnh có giá trị m/z
thấp hơn, như m/z 684 được dịch chuyển 74 Da từ m/z 610. 74 Da ở đây là KCl hoặc polysiloxanes. Từ những kết quả này, có thể khẳng định khối lượng của chất C6 là 610. Sau đó, sử dụng phần mềm Xcalibur để đưa ra kết quả dự kiến thành phần nguyên tố mẫu chất C6, chúng tôi thu được bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần nguyên tố của hợp chất C6 m/z m/z Số thứ tự Thành phần khối lượng lý thuyết Delta (mmu) Cân bằng RDB Thành phần Hợp chất 610,18
1 610,19 -0,62 13,5 C22 H28 O12 N9 Không tồn tại
2 610,19 -1,97 13,0 C24 H30 O13 N6 Không tồn tại
3 610,18 2,06 9,0 C19 H30 O15 N8 Không tồn tại
4 610,19 -3,30 18,0 C25 H26 O9 N10 Không tồn tại
5 610,19 -3,31 12,5 C26 H32 O14 N3 Không tồn tại
6 610,19 -4,65 17,5 C27 H28 O10 N7 Không tồn tại
7 610,19 -4,65 12,0 C28 H34 O15 Hesperidin,
Neohesperidin
8 610,18 5,24 17,0 C30 H30 O12 N2 Không tồn tại
9 610,18 5,25 22,5 C29 H24 O7 N9 Không tồn tại
10 610,19 -5,99 17,0 C29 H30 O11 N4 Không tồn tại
Như thể hiện trong bảng trên, 10 hợp chất với các thành phần nguyên tố tương tự chất C6 có thể trở thành ứng cử viên cho chất C6. Dựa vào ngân hàng dữ liệu có sẵn về các hợp chất, chỉ có hợp chất C28H34O15 được tìm thấy tương ứng với hợp chất hiện có, với tên hesperidin và neohesperidin. Như vậy, từ kết quả ESI-MS, chúng tôi định hướng mẫu chất C6 là hesperidin hoặc neohesperidin.
3.2.2.2. Xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân chất C6
Từ kết quả đo phổ khối lượng, định hướng chất C6 là hesperidin hoặc neohesperidin, chúng tôi tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon
của hợp chất neohesperidin chuẩn và chất C6, kết quả phổ được thể hiện trong các hình 3.9, 3.10, 3.11 và 3.12.
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của Neohesperidin chuẩn
Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của Neohesperidin chuẩn
Bảng 3.6. Bảng so sánh giá trị peak của Neohesperidin chuẩn và chất C6 1H STT Neohesperidin_St C6 13C Nehesperidin_St C6 1H STT Neohesperidin_St C6 13C Nehesperidin_St C6 ppm 1 12,011 N/A ppm 197,711~197,558 N/A 2 9,091 9,19 N/A 177,375 3 N/A 8,880 N/A 173,703 4 N/A 8,767 N/A 171,518 5 6,841 6,815 165,385~165,280 166,778 6 N/A 6,32 163,458~163,125 161,541 7 6,090~6,060 6,113 N/A 157,106 8 5,294~5,086 5,258 N/A 156,925 9 4,703~4,557 4,362 148,569 149,437 10 N/A 4,004 147,014 145,546 11 N/A 3,975 131,419~131,343 133,632 12 3,744 3,79 N/A 127,27 13 3,649 3,682 N/A 121,423 14 N/A 3,167 118,476~118,361 116,73 15 N/A 3,492 114,737~112,543 115,881 16 3,425 3,475 103,873 103,596 17 3,407 3,409 100,963 102,499 18 3,346 3,344 100,925 101,984 19 N/A 3,325 N/A 101,24 20 3,29 3,259 97,949~97,835 99,896 21 N/A 3,218 96,805~95,708 94,525 22 N/A 3,194 N/A 84,262 23 N/A 3,057 79,225~78,958 76,974 24 N/A 3,006 77,671~77,732 76,316 25 2,761~2,708 2,987 76,717~76,612 74,599
26 2,474~2,467 2,473 72,358 68,762 27 N/A 2,27 71,003~70,116 67,522 28 N/A 2,248 68,819 67,131 29 N/A 1,944 60,969 60,33 30 1,142~1,130 1,143 N/A 57,402 31 1,041 1,114 56,219 55,637 32 1,027~1,012 1,129 N/A 53,768 33 N/A 0,932 N/A 45,746 34 N/A 0,806 42,684 42,579 35 N/A 0,712
Chú thích: N/A là khơng tồn tại
Tiến hành so sánh giá trị các tín hiệu thu được ở phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất chuẩn neohesperidin và chất C6 (bảng 3.6), chúng tôi nhận thấy các tín hiệu chính tương đồng nhau với nhau, giá trị phổ của chất C6 xuất hiện một số peak nhiễu, có thể được giải thích là do các dung môi chưa được tách hết ra khỏi hợp chất.
Kết hợp với giá trị phổ khối lượng đã đo được, chúng tôi kết luận chất C6 là neohesperidin với cấu trúc hóa học được thể hiện trong hình 3.13:
3.3. Đánh giá khả năng làm giảm sự tích lũy β-amyloid
3.3.1. Hoạt tính chống oxi hóa
Vitamin C là một chất chống oxi hóa có nhiều trong các loại thực vật. Hoạt tính chống oxi hóa của nó đã được nghiên cứu đầy đủ và rõ ràng. Vì vậy trong phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH, chúng tôi sử dụng vitamin C làm chất chuẩn để so sánh với các chất chuẩn quercetin, rutin, các chất tinh sạch được từ dịch chiết nụ hoa hịe khơ. Kết quả xây dựng đường chuẩn vitamin C với nồng độ từ 100 µg/ml đến 700 µg/ml được thể hiện trong hình 3.14 dưới đây.
Hình 3.14. Đồ thị đường chuẩn khả năng chống oxi hóa của vitamin C
Đường chuẩn vitamin C tuyến tính với giá trị R2
= 0,982. Từ đường chuẩn, kết hợp với giá trị độ hấp thụ của các chất quercetin, rutin chuẩn, chất C2 và C6, chúng tơi tính tốn và đưa ra bảng so sánh giá trị quét gốc tự do của các chất trong bảng 3.7 sau:
5,647 19,977 22,702 35,169 46,647 54,525 59,198 y = 0,0906x - 1,4038 R² = 0,982 ,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Khả năng chống oxi hóa (%) Nồng độ vitamin C (µg/ml)
Bảng 3.7. Giá trị quét gốc tự do DPPH của các chất
Quercetin
chuẩn C2 Rutin chuẩn C6
Nồng độ (µM) 200 20 200 20 200 20 200 20
Khả năng bắt
gốc tự do (%) 91,3 9,57 69,86 5,28 91,44 14,6 91,11 11,81 Trong điều kiện thí nghiệm, khả năng bắt gốc tự do của các chất giảm đáng kể khi nồng độ bị pha loãng 10 lần. So sánh với khả năng bắt gốc tự do của vitamin C, ta có thể thấy quercetin chuẩn, chất C2, rutin chuẩn, và chất C6 tại nồng độ 20 µM có hoạt tính tương đương với vitamin C nồng độ từ 100-200 µg/ml. Cịn tại nồng độ 200 µM, các chất thử nghiệm có hoạt tính cao hơn hẳn vitamin C tại nồng độ 700 µg/ml.
So sánh khả năng bắt gốc tự do của chất C2 và quercetin chuẩn, nhận thấy quercetin chuẩn thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ hơn, tại nồng độ 200 µM là 91,3% so với 69,86%, tại nồng độ 20 µM là 9,57% so với 5,28%. Tương tự, cũng nhận thấy khả năng chống oxi hóa mạnh hơn của rutin chuẩn so với chất C6,
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, tùy vào điều kiện thí nghiệm, mơi trường đệm, độ pH, nồng độ DPPH, nồng độ chất thử nghiệm mà quercetin và rutin thể hiện hoạt tính chống oxi hóa, qt gốc tự do DPPH khác nhau [52, 65].
3.3.2. Hoạt tính làm giảm sự tích tụ peptide β-amyloid
Sự tập hợp protein để tạo thành sợi amyloid là một đặc tính phổ biến trong các bệnh rối loạn ở con người như bệnh Alzheimer.
Thioflavin T là một chất đánh dấu thường được sử dụng để theo dõi sự hình thành sợi amyloid in vitro. Khi gắn với các sợi amyloid, ThT cho tín hiệu huỳnh quang mạnh hơn. Dựa vào đặc tính này, chúng tơi ghi nhận sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang của thioflavin T trong các mẫu thí nghiệm khác nhau. Sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang được tính tốn và thể hiện trong hình 3.15.
Trong đó: Aβ là β-amyloid peptide trong điều kiện bình thường Qc: mẫu β-amyloid khi có mặt quercetin chuẩn
Rc: mẫu β-amyloid khi có mặt rutin chuẩn C2: mẫu β-amyloid khi có mặt của chất C2 C6: mẫu β-amyloid khi có mặt của chất C6
89,643 46,857 78,214 51,143 80,571 ,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 90,000 100,000 Aβ Qc Rc C2 C6 Phần trăm tích lũy Các chất thử nghiệm
Trong điều kiện thường, khơng có mặt của các chất ức chế, tỉ lệ tạo thành sợi của β-amyloid là 89,64%. Với sự có mặt của chất ức chế quercetin chuẩn, tỉ lệ tạo thành sợi chỉ còn 46,86%, tỉ lệ này thấp hơn khi có mặt của chất C2 là 51,14%. Với sự có mặt của chất chuẩn Rutin, khả năng tạo sợi của β-amyloid giảm khoảng 11% còn 78,21%. Chất C6 có khả năng ức chế kém hơn rutin chuẩn, khả năng tạo sợi của β- amyloid khi có mặt chất này là 80,87%.
Theo See-Lok Ho và cộng sự, với sự xuất hiện của quercetin và neohesperidin ở nồng độ 200 µM, β-amyloid giảm đáng kể sự hình thành sợi peptide, Trong mơi trường đệm có mặt neohesperidin hoặc quercetin, các monomer β-amyloid tồn tại trong thời gian dài hơn trước khi tạo thành oligomer và tạo sợi peptide so với trong môi trường đệm phosphate đối chứng [49]. Karim và cộng sự cũng đã chứng minh quercetin và rutin ngăn cản sự tạo thành sợi và sự tích tụ của β-amyloid in vitro thơng qua mơ hình tế bào APPswe [30].
KẾT LUẬN
Đã tinh sạch được hai chất C2 và C6 từ dịch chiết nụ hoa hịe khơ. Chất C2 được xác định là quercetin, chất C6 được xác định là neohesperidin.
Các chất quercetin chuẩn, rutin chuẩn, C2 và C6 tại nồng độ 20 µM thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tương đương với vitamin C chuẩn nồng độ từ 100 đến 200 µg/ml.
Các chất quercetin chuẩn, rutin chuẩn, C2 và C6 tại nồng độ 1 mM thể hiện hoạt tính chống lại sự tích tụ peptide β-amyloid. Trong mơi trường có mặt các chất này, tỉ lệ tích tụ β-amyloid lần lượt là: 46,86%, 78,21%, 51,14% và 80,57%.
KIẾN NGHỊ
Chúng tôi kiến nghị thực hiện tiếp các nghiên cứu về khả năng ức chế sự tích tụ β-amyloid trên mơ hình tế bào và mơ hình động vật thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư (2013). "Stress oxi hóa và các chất chống oxi hóa tự nhiên", Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(5), tr.667-677.
2. Nguyễn Ngọc Hòa (2006). Nghiên cứu tỷ lệ mắc và một số yếu tố liên quan đến SSTT ở người cao tuổi huyện Ba Vì, tỉnh Hà Tây 2005-2006, Hà Nội, Đại học Y Hà Nội.
3. Lê Quốc Nam và Trần Duy Tâm(2007). "Khảo sát sơ bộ tỷ lệ sa sút tâm thần trong cộng đồng dân", Nghiên cứu khoa học tại Bệnh viện Tâm thần TP. Hồ Chí Minh.
4. Phạm Thắng (2010), Bệnh Alzheimer và các thể sa sút trí tuệ khác, Hà Nội, Nhà
Xuất bản Y học.
5. Phạm Thắng (2007), Chẩn đoán và điều trị bệnh Alzheimer, Hà Nội, Nhà xuất bản Y học.
6. Hoàng Văn Tuấn (2013). "Nghiên cứu tách chiết và xác định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (Hoyttuynia cordata Thunberg) thu hái tại Hà Nội", Tạp chí Sinh học, 35(3), tr.183-187.
7. Lê Văn Tuấn (2010). "Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học sa sút trí tuệ và suy giảm nhận thức nhẹ (MCI) ở người cao tuổi Hà Nội, Mã số 01C-08/08-2009-2", Đề tài
nghiên cứu cấp thành phố, Hà Nội,
8. Đỗ Thị Hoa Viên (2007). "Nghiên cứu khảo sát hoạt chất flavonoid trong quả mơ Prunus armeniaca (họ Rosaceae)", Tạp chí Khoa học và cơng nghệ, 45(2), tr.49-53.
Tài liệu tiếng Anh
9. Arranz S. and Chiva-Blanch G. (2012). "Wine, beer, alcohol and polyphenols on cardiovascular disease and cancer", Nutrients, 4(7), pp.759-781.
10. Barrie M.P., Rhiannon B., Alfred T. and Louis A.T. (2016), The Life-Cycle of Pharmaceuticals in the Environment, Woodhead Publishing.
11. Cao X. and Sudhof T.C. (2001). "A transcriptively active complex of APP with Fe65 and histone acetyltransferase Tip60", Science, 293(8), pp.115-120.
12. Cheignon C., Thomas M., Faller P., Hureau C. and Collin F. (2018). "Oxidative stress and the amyloid beta peptide in Alzheimer’s disease", Redox Biology, 14(5), pp.450-464.
13. Christine X., Tiffany Y.L., Dennis C. and Zhefeng G. (2017). "Thioflavin T as an amyloid dye: fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation",
Royal Society Open Science, 4(1), pp.16069-16072.
14. Dai J. and Mumper R.J. (2010). "Plant Phenolics: Extraction. Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties", Molecules, 15(2), pp.7313-7352.
15. Dasha M. and Sebastian S. (2013). "Antioxidant and Stabilization Activity of a Quercetin Containing Flavonoid Extract Obtained from Bulgarian Sophora japonica L.", Brazilian Archives of Biology and Technology, 56(3), pp.431-438.
16. Ding B.J., Ma W. and He L.L. (2011). "Soybean isoflavone alleviates β-amyloid 1-