Chương 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3. Phương pháp sắc ký cột
Nguyên tắc: Sắc ký cột là phương pháp sắc ký được sử dụng để phân lập một hợp chất hóa học đơn lẻ từ hỗn hợp dựa trên sự hấp phụ khác nhau. Các hợp chất di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau, cho phép chúng được tách thành các phân đoạn. Tương tự sắc ký bản mỏng, sắc ký cột bao gồm pha động và và pha tĩnh. Pha tĩnh là các loại chất hấp phụ khác nhau (thường là silica gel SiO2 hoặc alumina Al2O3) được nhồi vào cột thủy tinh thẳng đứng, pha động – dạng lỏng, được rót vào từ trên đỉnh cột và chảy xuống dưới cột nhờ tác dụng của trọng lực hoặc của áp suất bên ngoài, là hệ các dung mơi dùng để rửa giải (hình 2.1). Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi vì tính đa dạng của chất hấp phụ (pha thường, pha đảo) và các loại dung mơi. Ưu điểm chính của sắt ký cột là chi phí tương đối thấp và dễ thao tác.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa cột sắc ký
Mục đích: Tách hỗn hợp cao chiết methanol thành các phân đoạn khác nhau trong các hệ dung môi, tiến hành tinh sạch để thu được các hợp chất.
Quy trình:
Chuẩn bị hệ dung mơi để chạy cột, thể tích mỗi hệ là 200 ml, bao gồm: Hệ dung môi 1: n- hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 5/5 Hệ dung môi 2: n-hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 2/8 Hệ dung môi 3: ethyl acetate 100%
Hệ dung môi 4: ethyl acetate/ethanol với tỉ lệ 5/5 Hệ dung môi 5: ethanol 100%
Hệ dung môi 6: ethanol/nước với tỉ lệ 8/2
Tiến hành nhồi cột ướt, rót hỗn hợp silica gel và dung môi vào cột. Mở van tháo dung môi với tốc độ chảy nhỏ để dung mơi thốt ra khỏi cột, tránh bị tràn. Kích thước cột sử dụng: chiều dài 60 cm, đường kính trong 3 cm.
Vừa nhồi vừa gõ nhẹ cột để bọt khí thốt ra ngồi và silica lắng xuống. Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột cho đến khi tất cả lượng silica gel đã hết.
Rửa thành cột bằng dung môi và mở van tháo dung môi đến khi mức dung môi cách bề mặt silica 2cm thì dừng lại.
Thêm 1 lớp cát mỏng để ổn định bề mặt silica gel.
Thêm 0,6g cao khô và bắt đầu chạy cột với hệ dung môi 1, tốc độ 45 giọt/phút. Khi hệ dung mơi 1 gần hết (cịn cách mặt phẳng cát khoảng 3 cm) thì tiếp tục
thêm hệ dung môi 2, Lặp lại bước này cho đến khi hết các hệ dung môi.
Đánh giá kết quả: Dựa vào màu sắc và thể tích dung môi để thu các phân đoạn
khác nhau, sử dụng sắc ký bản mỏng để xác định số lượng các chất trong phân đoạn, đồng thời so sánh với giá trị Rf của chất chuẩn Quercetin và Rutin. Từ kết quả này, xác định các phân đoạn chỉ chứa một hợp chất duy nhất để tiến hành tinh sạch.