STT Hệ dung môi Tên phân đoạn Màu sắc
1 1 C1 Xanh vàng 2 2 C2 Vàng 3 3 C3 Xanh 4 4 C4 Cam 5 5 C5 Vàng cam 6 6 C6 Vàng nhạt
Như vậy, có 6 phân đoạn khác nhau thu được từ cao chiết nụ hoa hịe khơ với các màu sắc được mơ tả trong bảng trên (hình 3.2)
Hình 3.2. Các phân đoạn khác nhau sau khi chạy sắc ký cột
Sau khi thu được các phân đoạn chất khác nhau, để xác định số lượng các chất có trong các phân đoạn này, chúng tơi sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng với hệ dung môi khai triển ethyl acetate/ethanol/acetic acid 25 mM = 4/1/1, thu được kết quả trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký cột
STT Tên phân đoạn Số lượng (chất) Giá trị Rf
1 C1 1 0,95 2 C2 1 0,89 3 C3 1 0,73 4 C4 1 0,68 5 C5 2 0,60 và 0,50 6 C6 1 0,50
Sau khi cô quay thu hồi dung môi từng phân đoạn chất thu được, vì nồng độ thấp nên các phân đoạn 1,3,4 và 5 không tạo được thành dạng bột. Chỉ có phân đoạn 2 và 6 (tương ứng với chất C2 và C6) lần lượt tạo thành bột có màu vàng xanh và vàng tươi.
Khi so sánh giá trị Rf của các chất thu được với hai chất chuẩn quercetin và rutin, chúng tôi thu được chất C2 và chất C6 có giá trị Rf lần lượt bằng với giá trị Rf của querctin chuẩn và rutin chuẩn (hình 3.3).
3.1.3. Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng
Dựa vào sự phân bố của các chất trong các dung môi là khác nhau và khả năng tạo tủa được quan sát trong q trình làm thí nghiệm. Chúng tơi sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng để thu được một chất kết tủa có màu vàng tươi (hình 3.4).
Hình 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng các chất C2 và C6 khi so sánh với quercetin và rutin chuẩn
Sau khi so sánh với giá trị Rf của quercetin và rutin chuẩn, nhận thấy chất kết tủa thu được có giá trị Rf bằng với giá trị Rf của Rutin chuẩn. Kết hợp với phương pháp sắc ký cột cổ điển, chúng tôi thu được bảng tổng kết về lượng các chất thu được từ dịch chiết nụ hoa hoè (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Tổng kết các chất tinh sạch và cao khơ thu được từ dịch chiết nụ hoa hịe
Mẫu hoa hịe (mg) Cao khơ (mg) C2 (mg) C6 (mg) 20000 3006 45 287 20000 2195 40 277 20000 2267 35 215 Trung bình 2489 40 260
Trung bình khối lượng cao khơ sau khi cô quay thu hồi dung môi chiếm khoảng 12,45% khối lượng mẫu ban đầu. Sau khi phân tách cao khô bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển và sắc ký lỏng-lỏng, thu được hai chất C2 và C6 lần lượt chiếm khoảng 0,2% và 1,3% khối lượng mẫu ban đầu. Hai chất C2 và C6 là hai hợp chất chính thu được từ mẫu hoa hịe khơ, để xác định thành phần hóa học và cấu trúc của hai chất này,
chúng tôi sử dụng phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp đo phổ khối lượng.
3.2. Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính
3.2.1. Xác định cấu trúc chất C2
Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp hiện đại và thường được sử dụng để xác định cấu trúc phức tạp của các hợp chất thiên nhiên. Qua đánh giá kết quả sắc ký bản mỏng bao gồm: giá trị Rf chất C2 bằng giá trị Rf của quercetin chuẩn, thuốc nhuộm vanillin và thuốc thử AlCl3 chỉ thị sự có mặt của nhóm chức flavonoids, chúng tơi định hướng chất C2 là một chất có tính chất tương tự quercetin. Vì vậy, chúng tơi tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của quercetin chuẩn và chất C2, kết quả được thể hiện trong hình 3.5 và hình 3.6.
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của quercetin chuẩn
Phổ này cho thấy ba loại tín hiệu proton: proton nhân thơm, tín hiệu proton hydroxyl của chất phân tích và tín hiệu proton của dung môi. Cấu trúc khung của flavonol là một flavon được thay thế ở vị 3 trên benzopyrone với một nhóm hydroxyl, làm cho nó trở thành một 3-hydroxyflavone. Hai proton thơm tại vị trí màu xanh da trời và đỏ, xuất hiện dưới dạng cấu trúc kép lần lượt ở mức 6,8 và 6,6 ppm, sự nhân đôi
phát sinh từ khớp nối xa trên hệ thống nhân thơm. Các proton tại vị trí màu hồng (5,53 ppm) và xanh lá cây (5,30 ppm) xuất hiện dưới dạng một cặp đôi và là các tín hiệu riêng vì có sự tách tín hiệu ở các khớp nối. Trong khi proton tại vị trí màu đen, cặp đôi với proton lân cận ở vị trí màu xanh da trời xuất hiện dưới dạng một tín hiệu đơi tại trung tâm ở 6,01 ppm. Các proton hydroxyl xuất hiện riêng rẽ với tín hiệu ở bến trái của phổ tại các giá trị 9,92, 8,72, 8,48 và 8,43,
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của C2
Phổ 1H-NMR của chất C2 cũng cho thấy sự xuất hiện của proton hydroxyl, proton nhân thơm và proton từ dung môi. Các giá trị phổ của chất C2 và chất chuẩn quercetin được so sánh trong bảng kết quả 3.4:
Bảng 3.4. Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2
1H NMR STT Quercetin_St C2 ppm 1 11,613 12,441 2 9,928 9,911 3 8,729 4 8,482 5 N/A 7,672
6 N/A 7,54 7 N/A 7,536 8 N/A 6,933 9 6,800~6,794 6,899 10 6,676 6,881 11 6,673~6,652 6,863 12 N/A 6,452 13 N/A 6,394 14 N/A 6,39 15 6,019~6,018 6,173 16 6,003~6,000 5,971 17 5,536~5,531 5,529 18 5,316~5,309 5,279 19 N/A 3,828 20 N/A 3,484 21 N/A 2,729 22 2,497 2,49 23 N/A 2,141 24 N/A 1,975 25 1,626 1,62 26 N/A 1,452 27 N/A 1,177 28 N/A 0,889 29 N/A 0,817
Chú thích: N/A là khơng tồn tại
Từ bảng so sánh 3.4 có thể thấy, các tín hiệu proton thu nhận được của chất C2 tương đồng với các tín hiệu đo được của quercetin chuẩn. Các tín hiệu chính thể hiện sự có mặt của các proton nhân thơm bao gồm tín hiệu 6,800~6,793 ppm đến 5,316- 5,309 đều quan sát được trong phổ đồ của chất C2. Ngoài ra, trong phổ đồ của chất C2
còn xuất hiện một số tín hiệu nhiễu. Vì q trình tinh sạch chất trải qua nhiều bước, sử dụng nhiều hệ dung mơi khác nhau, nên các tín hiệu nhiễu trong phổ đồ có thể được giải thích là do các dung mơi chưa được loại bỏ hồn tồn khỏi chất tinh sạch.
Kết hợp các dữ liệu thu được bao gồm: giá trị Rf tương đồng với quercetin chuẩn, giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H tương đồng với chất quercetin. Chúng tôi dự kiến chất C2 là quercetin với công thức cấu tạo như sau:
Quercetin là một flavonoids phổ biến trong tự nhiên, thuộc nhóm polyphenols, có nhiều trong các loại rau, củ, quả. Đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc, đặc tính, cơng dụng và chức năng của quercetin. Thêm vào đó, Dasha cùng cộng sự đã xác định quercetin là một thành phần được tìm thấy trong cây Sophora japonica, đồng thời các nghiên cứu khác cũng chỉ ra sự xuất hiện của quercetin trong các họ thực vật khác nhau [15, 26]. Điều này củng cố thêm rằng chất C2 là quercetin và kết quả chúng tôi thu được là tương đồng với những nghiên cứu trước đây.
3.2.2. Xác định cấu trúc chất C6
Dựa trên các kết quả đã thu được bao gồm: giá trị Rf bằng với rutin chuẩn và sự tồn tại của khung flavonoids thông qua sự chỉ thị của thuốc thử vanillin và AlCl3, chúng tơi định hướng chất C6 có tính chất tương tự như rutin. Rutin là một flavonoids bao gồm 2 thành phần gốc quercetin flavonol và đường đôi rutinose. Đây là một hợp chất tự nhiên với cấu trúc tương đối phức tạp. Vì vậy, với mục tiêu xác định thành phần hóa
học và khối lượng của chất C6, chúng tôi kết hợp sử dụng 2 phương pháp đo phổ khối lượng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
3.2.2.1. Xác định phổ khối lượng chất C6
Phổ khối lượng với nguồn ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion (ESI- MS) được thực hiện trên thiết bị LTQ-Orbitrap XL. Kết quả phổ được thể hiện trong hình 3.8.
Hình 3.8. Phổ khối lượng ESI của chất C6
Chú thích: Các số ở trên mỗi đỉnh thể hiện giá trị m/z. Giá trị Z chỉ trạng thái tích điện của các tín hiệu
Trong phổi khối lượng này, giá trị m/z 610 đã được phát hiện. Ngoài ra, các đỉnh với giá trị m/z lớn hơn 610 cũng được phát hiện. Những đỉnh này được xác định là chất có giá trị m/z 610 được thêm một chất khác. Ví dụ, giá trị m/z 633 (lớn hơn m/z 610) là kết quả của sự hợp nhất giữa ion natri với hợp chất có giá trị m/z 610 vì khối lượng ion natri là 23, Các đỉnh khác dịch chuyển 74 Da so với các đỉnh có giá trị m/z