Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.3. Phương pháp địnhlượng β-glucan
Để lựa chọn các chủng nấm men có hàm lượng β-glucan cao chúng tơi tiến hành nuôi cấy các chủng nấm men thu sinh khối và địnhlượng β-glucan.Các chủng nấm men được ni lắc trong bình tam giác 250 chứa 100ml mơi trường MT1 ở 30oC, sau 30 giờ, ly tâm thu sinh khối nấm men, sấy ở 80oC trong 4 giờ và tiến hành định lượng β-glucan sử dụng kít định lượng β-glucan (Mushroom and yeast β- glucan assay, Megazyme)[29].
Định lượng tổng glucan
Cân khoảng 0,1 g sinh khối khô vào ống nghiệm, thêm 1,5 ml acid HCl đậm đặc 37% vào mỗi ống nghiệm, đóng nắp và trộn đều bằng vortex. Ủ các ống nghiệm ở 300C trong 45 phút, votex mẫu sau mỗi 10 phút.Thêm 10 ml nước cất vào mỗi ống nghiệm, đậy nắp và vortex đều. Đun sôi trên bể cách thủy trong 2 giờ.
Làm nguội nhanh đến nhiệt độ phịng. Chuyển tồn bộ dịch thu được trong mỗi ống nghiệm vào bình định mức 100 ml, dùng đệm natri acetat 200mM (pH 5,0) tráng sạch ống nghiệm và thêm vào 10 ml KOH 2 N. Thêm vừa đủ đến vạch mức bằng đệm natri acetat 200mM (pH 5,0). Trộn đều mẫu, sau đó ly tâm 1500v/phút
trong 10 phút. Hút 0,1 ml dung dịch thu được vào đáy của ống nghiệm, thực hiện với 3 ống nghiệm. Thêm 0,1 ml dung dịch Enzyme Glucazyme vào đáy chứa mẫu của các ống nghiệm, vortex đều và ủ ở 400C trong 60 phút.
Thêm 3,0 ml dung dịch Enzyme GOPOD vào 3 ống nghiệm chứa mẫu ở bước trên và các ống nghiệm Control, ống Blank, ống D-glucose chuẩn. Ủ ở 400C trong 20 phút.
+ Ống Blank: chứa 0,2 ml dung dịch đệm Natri acetat 200 mM (pH 5,0).
+ Ống D-Glucose chuẩn: chứa 0,1 ml dung dịch D-Glucose chuẩn (1,0 mg/ml) và 0,1 ml dung dịch đệm Natri acetat 200 mM (pH 5,0). Thực hiện 2 ống để lấy giá trị trung bình. Làm nguội nhanh đên nhiệt độ phòng và đo quang ở bước sóng 510 nm, dung dịch blank được lấy từ ống Blank.
Định lượng tổng α-Glucan:
Cân khoảng 0,1 g sinh khối khô vào ống nghiệm 18x180mm thêm 2,0 ml dung dịch KOH 2M, đặt ống nghiệm trong khay nước đá ủ 30 phút.Thêm 8 ml đệm natri acetat 1,2 M (pH 3,8) và 0,2 ml enzyme amyloglucosidase, vontex đều và chuyển vào ủ ở 400C trong 30 phút. Toàn bộ dịch thu đượcly tâm ở 1500 v/phút trong 10 phút. Chuyển 0,1 ml dịch sau ly tâm vào ống nghiệm, thêm 0,1 ml đệm natri acetat 200mM (pH 5,0). Thêm 3,0 ml dung dịch Enzyme GOPOD vào 3 ống nghiệm chứa mẫu ở bước trên. Ủ ở 400C trong 20 phút.Làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng và đo quang ở bước sóng 510 nm, dung dịch blank được lấy từ ống Blank.
Tính hàm lượng % β-glucan (w/w):
- Hàm lượng % (w/w) tổng Glucan (gồm β –Glucan và α-Glucan): Tổng Glucan (% w/w) = ΔE x F x 100/0,1 x 1/1000 x 100/W x 162/180
= ΔE x F/W x 90 - Hàm lượng % (w/w) α-Glucan):
- Hàm lượng % (w/w) của β –Glucan:
β –Glucan = Tổng Glucan – α-Glucan Trong đó,
+ ΔE: Độ hấp thụ của trung bình của ống chứa mẫu trừ blank.
+ F: Hệ số chuyển đổi từ độ hấp thụ của dung dịch D-Glucose sang µg. + W: Lượng mẫu cân, mg.
+ 100/W: Tính hàm lượng % của β-glucan trong lượng mẫu cân.
+ 162/180: Hệ số chuyển đổi do sai khác KLPT của D-Glucose tự do và monomer glucose trong mạch β-glucan