STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G 1 HD1 6,32 23 BM 17 6,26 45 S43 5,37 2 HD2 4,16 24 BM 18 7,41 46 S48 7,72 3 HD5 4,33 25 BM 21 6,34 47 S49 6,86 4 HD9 8,69 26 BM 32 10,1 48 S50 7,91 5 HD10 7,93 27 BM 33 5,67 49 HD2.3 7,89 6 HD23 8,44 28 BM 37 7,89 50 HD2.42 5,92 7 HD25 5,19 29 BM 38 5,38 51 HD2.49 8,19 8 HD27 8,21 30 Q1.1 8,19 52 HD3.8 6,48 9 HD30 7,43 31 Q1.2 6,67 53 HD3.12 7,18 10 HD31 8,43 32 Q1.5 7,58 54 HD4.11 7,8 11 HD37 7,66 33 Q2.2 5,67 55 HD4.13 5,55 12 HD42 7,23 34 Q2.3 7,89 56 HD4.15 5,69 13 HD47 5,64 35 Q3.4 5,38 57 HD4.16 8,08 14 HD55 7,23 36 Q3.6 8,19 58 S51 9,88 15 QA2.3 5,77 37 Q3.7 5,23 59 S60 6,21
STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G STT Chủng %β.G 16 QA2.8 8,12 38 S6 5,87 60 S62 6,75 17 QA2.23 7,45 39 S12 7,17 61 D4 5,89 18 QA3.2 7,46 40 S20 7,37 62 D5 7,33 19 QA3.3 7,27 41 S26 8,58 63 N4 8,23 20 QA3.5 7,68 42 S34 6,43 64 N6 8,63 21 QA3.9 8,42 43 S41 8,27 22 BM 13 8,28 44 S42 5,2
Bảng số liệu trên cho thấy có 15 chủng nấm men có hàm lượng β-glucan trong vách tế bào nằm trong khoảng từ 4-6%, 31 chủng nấm men có hàm lượng β-glucan trong vách tế bào nằm trong khoảng 6-8% và 18 chủng nấm men có hàm lượng β- glucan trong vách tế bào nằm trong khoảng ≥8%. Trong đó, chủng nấm men S51 và chủng nấm men BM 32 có hàm lượng β-glucan cao nhất trong tổng số 64 chủng nấm men lựa chọn (β-glucan S51: 10,1%; BM32: 9,88%). Chủng nấm men S51 phân lập từ mẫu xồi chín thu thập tại Hoài Đức-Hà Nội và BM32 phân lập từ mẫu bánh men rượu thu thập tại Quốc Oai- Hà Nội. 2 chủng đều có khả năng phát triển tốt (hình 3.1). Lựa chọn 2 chủng này để tiếp tục nghiên cứu lựa chọn mơi trường ni cấy thu sinh khối nấm men.Hình 3.1 là hình ảnh ni cấy lắc chủng nấm men BM32 và S51 trên môi trường lỏng Hansen ở nhiệt độ 30oC với thời gian 30 giờ
3.1.2. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái chủng S51
+ Khuẩn lạc: Sau 4 ngày ni cấy trên đĩa thạch mơi trường Hansen, khuẩn lạc có màu trắng, hình trịn, lồi, bề mặt nhẵn, bóng, mép trơn, kích thước 3.5 - 6.0 mm, khơng tiết sắc tố vào môi trường
+ Sau 2 ngày nuôi tĩnh trên môi trường Hansen dịch thể tế bào có dạng hình cầu, hình trứng, nảy chồi 1- 2 phía, kích thước (2.5-3.5) x (3.0-4.0) µm, bar = 5 µm.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng S51
Đặc điểm hình thái chủng BM 32
+ Sau 4 ngày nuôi cấy trên đĩa thạch mơi trường Hansen, khuẩn lạc có màu trắng, hình trịn, lồi, bề mặt nhẵn, bóng mép trơn đều hoặc có gờ, kích thước 0.5 – 1.5 mm, khơng tiết sắc tố vào môi trường.
+ Tế bào: Sau 2 ngày nuôi tĩnh trên mơi trường Hansen dịch thể tế bào có dạng hình trứng, hình elip, nảy chồi 1 phía, kích thước (4.0-6.0) x (4.5-6.5) µm, bar = 5 µm.
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng BM 32
3.1.3. Định danh và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Chủng nấm men S51 và BM 32 được nuôi cấy trên môi trường MT1 lỏng, sau 48 giờ, ly tâm lấy phần sinh khối. DNA genome của 2 chủng nấm men nghiên cứu được tách chiết và dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen ITS bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4. Sản phẩm sau PCR được xác định có kích thước khoảng 700 bp. Chương trình Blast được sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự của các lồi có quan hệ họ hàng gần. Cây phát sinh chủng loại của chủng nghiên cứu với 16 loài thuộc chi Saccaromyces và Kluyveromyces đã được xây dựng dựa vào trình tự đoạn gen ITS, Zygosaccharomyces rouxiiđược sử dụng
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng nấm men nghiên cứu
Trình tự ADNr ITS của chủngBM 32 tương đồng 99,85% với trình tự ADNr ITS của Kluyveromyces lactis_KY103776(679/680 bp). Trình tự ADNr ITS của
chủngS51tương đồng 99,56% với trình tự ADNr ITS của Saccharomyces cerevisiae_AY046146(677/680 bp).
Từ các kết quả hình thái và phân tích trình tự ADNr ITS chủng BM 32 thuộc loài
Kluyveromyces lactis và chủng S51 thuộc Saccharomyces cerevisiae. Chủng
S.cerevisiae là chủng nấm men phổ biến sử dụng trong các nghiên cứu vềphân lập và thu hồi vách tế bào giàu nguồn β-glucan. Nguồn β-glucan chiết xuất từ chủng này đã được thương mại hóa trong nhiều thuốc thành phẩm sử dụng cho con người. Do đó, trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi vẫn tiếp tục lựa chọn chủng nấm men này với hi vọng có thể nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu hổi β-glucan. Đối với chủng Kluyveromyces lactis, đây là chủng còn khá mới mẻ trong các nguồn nấm
được sử dụng để chiết xuất, chúng tôi lựa chọn phân lập và nghiên cứu thử nghiệm tách chiết thu hồi β-glucan để so sánh với các chủng giống đã được sử dụng trước đây.
3.2. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THU SINH KHỐI NẤM MEN GIÀUΒ-GLUCAN Β-GLUCAN
3.2.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men
Sau khi lựa chọn được chủng nấm men có hàm lượng β-glucan cao, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu lựa chọn mơi trường thích hợp để thu sinh khối nấm men. Các môi trường chúng tôi lựa chọn được ký hiệu: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5. Lấy 1 vòng que cấymỗi chủng nấm men trong ống thạch nghiêng đưa vào bình tam giác 250 ml chứa 50ml mơi trường MT1 dịch thể, nuôi lắc ở 30oC trong 24 giờ. Nhũ dịch sau nuôi cấy được gọi là dịch giống cấy. Cấy vào bình tam giác chứa các mơi trường khác nhau 5% giống cấy, nuôi lắc ở 30oC. Sau 48 giờ, định lượng mật độ tế bào nấm men bằng phương pháp đổ đĩa thạch. Kết quả trung bình sau 3 lần thí nghiệm độc lập được trình bày ở bảng 3.3.