Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.1. Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa vào đọc trình tự DNA
Tách chiết DNA nấm men: sử dụng bộ kít tách chiết DNA tổng sốnấm: Norgen, Canada
Chủng nấm men được nuôi 5 ngày trong môi trường Hansen. Cho 100l đệm lysis vào ống nhựa 1,5 ml, lấy một vòng que cấy sinh khối và trộn thật đều bằng máy vortex. Đun ở 100oC trong vòng 15 phút. Thêm 100 l axetatkali trộn đều và đặt trên đá 1 giờ. Ly tâm lạnh 4oC ở 15.000 vịng/phút trong 5 phút, lấy phần nổi phía trên. Thêm 200 l CHCl3-Isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000 v/ph trong 2 phút, sau đó lấy phần nổi phía trên, làm lại như vậy lần nữa. Thêm 200 l 2- propanol (Iso-propanol) và đặt trong đá 20 phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 15 phút và lấy phần kết tủa. Rửa sạch phần tủa (pellet) bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút và lấy tủa. Làm khô bằng ly tâm ở 4oC trong 10 phút. Hoà tan tủa trong TE (30-50 l), giữ trong tủ lạnh 4oC trong 1 ngày. Giữ ở -20oC trước khi sử dụng.
Hoá chất phản ứng
- Lysis buffer: 100 mM Tris-HCl; 30mM EDTA và 0,5 % SDS (pH 8) - 2,5 M axetat kali (pH 7.5)
- CHCl3-I soamyl alcohol (24:1 v/v) - 2-propanol
- 70% etanol
- Dung dịch TE: 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA
Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide (nồng độ 0,5l/ml)và quan sát dưới tia cực tím.
b. Phản ứng khuếch đại DNA
Thành phần phản ứng
Thành phần Thể tích (l)
10X buffer 10
dNTP 2.0 mM 10
Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 Mồi ngược (10 pmol/l) 2
Taq polymerase (5u/l) 2 ADN khn (50-100g/l) 1-2 H2O đủ 100 Chu trình nhiệt: 95oC - 3 phút 95oC - 30giây 50oC - 45 giây 30 chu kỳ 72oC - 1 phút 72oC - 5 phút 4oC -
Mồi xuôi ITS1-F: 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3'. Mồi ngược ITS4-R: 5'- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'
- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Làm tương tự như điện di DNA genome.
c. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kit Norgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1, trộn đều. Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút. Đổ bỏ dịch phía dưới cột.Bổ sung 750 l PE buffer lên cột. Ly tâm
10.000 v/p trong 1 phút . Đổ bỏ dịch dưới cột . Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút. Chuyển cột sang ống Eppendoft mới. Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút. Lấy dịch phía dưới.Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:
Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch: 1,6 < OD260/ OD280< 1,8.
d. Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự
- Terminator Ready Reaction Mix (Termix):
Buffer 5X 9l
- Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự:
Termix 8l
Mồi ITS1, ITS4 1l
DNA khuôn 1l (nồng độ ADN = 40-60g/ml)
H2O 10l
- Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen: 960C - 4phút
960C - 10giây 30 chu kỳ 500C - 45 giây
700C - 7 phút
e. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự
Chuyển 20l sản phẩm sang ống Eppendorf sạch. Thêm 5l EDTA 125mM và 60l ethanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.Ly tâm 15.000v/p, 15phút. Bỏ dịch, thêm 60l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 phút, làm khô. Thêm 10l HiDi Formamide. Để ở 96oC trong 2 phút sau đó cho ngay mẫu vào nước đá lạnh. Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự. Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100Avant