Trình tự ADNr ITS của chủngBM 32 tương đồng 99,85% với trình tự ADNr ITS của Kluyveromyces lactis_KY103776(679/680 bp). Trình tự ADNr ITS của
chủngS51tương đồng 99,56% với trình tự ADNr ITS của Saccharomyces cerevisiae_AY046146(677/680 bp).
Từ các kết quả hình thái và phân tích trình tự ADNr ITS chủng BM 32 thuộc lồi
Kluyveromyces lactis và chủng S51 thuộc Saccharomyces cerevisiae. Chủng
S.cerevisiae là chủng nấm men phổ biến sử dụng trong các nghiên cứu vềphân lập và thu hồi vách tế bào giàu nguồn β-glucan. Nguồn β-glucan chiết xuất từ chủng này đã được thương mại hóa trong nhiều thuốc thành phẩm sử dụng cho con người. Do đó, trong khn khổ luận văn này chúng tơi vẫn tiếp tục lựa chọn chủng nấm men này với hi vọng có thể nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu hổi β-glucan. Đối với chủng Kluyveromyces lactis, đây là chủng còn khá mới mẻ trong các nguồn nấm
được sử dụng để chiết xuất, chúng tôi lựa chọn phân lập và nghiên cứu thử nghiệm tách chiết thu hồi β-glucan để so sánh với các chủng giống đã được sử dụng trước đây.
3.2. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THU SINH KHỐI NẤM MEN GIÀUΒ-GLUCAN Β-GLUCAN
3.2.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm men
Sau khi lựa chọn được chủng nấm men có hàm lượng β-glucan cao, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu lựa chọn mơi trường thích hợp để thu sinh khối nấm men. Các mơi trường chúng tôi lựa chọn được ký hiệu: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5. Lấy 1 vòng que cấymỗi chủng nấm men trong ống thạch nghiêng đưa vào bình tam giác 250 ml chứa 50ml môi trường MT1 dịch thể, nuôi lắc ở 30oC trong 24 giờ. Nhũ dịch sau nuôi cấy được gọi là dịch giống cấy. Cấy vào bình tam giác chứa các mơi trường khác nhau 5% giống cấy, nuôi lắc ở 30oC. Sau 48 giờ, định lượng mật độ tế bào nấm men bằng phương pháp đổ đĩa thạch. Kết quả trung bình sau 3 lần thí nghiệm độc lập được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy cho 2 chủng nấm men nghiên cứu
Tên chủng
Mật độ nấm men (Ax107CFU/ml)
MT1 MT2 MT3 MT4 MT5
BM32 2,3 4,3 8,9 45 12
S51 3,4 2,1 10,6 56,9 12,5
Từ bảng trên cho thấy mật độ 2 chủng nấm men BM32 và S51 sau nuôi cấy ở các môi trường khác nhau là khác nhau. Khi nuôi cấy ở môi trường MT1 mật độ cả 2 chủng nấm men thu đượctương đối thấp so với các mơi trường cịn lại. Cụ thể, mật độ nấm men thu được là 2,3x107 CFU/ml đối với chủng BM32 và 3,4 x107
CFU/ml đối với chủng S51. Mật độ nấm men cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường MT4, chủng BM32 là 45x107 CFU/ml và chủng S51 là 56,9x107 CFU/ml. Chúng tôi lựa chọn mơi trường MT4 để tiếp tục nghiên cứu các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy nấm men
Cấy 5 ml dịch giống hai chủng S51 và BM32 vào bình tam giác chứa 100 ml mơi trường MT4, ni lắc ở 150v/p với dải nhiệt độ thay đổi: 25; 28; 30; 32; 35oC, sau 30 giờ, định lượng mật độ nấm men, kết quả được mô tả ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Mật độ 2 chủng nấm men khi nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau
Tên chủng
Mật độ nấm men ( Ax107CFU/ml)
25oC 28oC 30oC 32oC 35oC
BM32 13 41 63 8,2 13
S51 8,1 27 44 7,8 26
Nhìn vào bảng số liệu có thể thấy nhiệt độ khơng làm thay đổi nhiều đến ni cấy tế bào nấm men. Có thể ni cấy nấm men ở dải nhiệt độ từ 25 đến 30oC, trong đó nhiệt độ ni cấy ở 30oC là thích hợp nhất đối với cả 2 chủng nấm men. Khi tăng nhiệt độ lên 32oC, mật độ nấm men bắt đầu giảm, 2 chủng nấm men nghiên cứu khơng thích hợp với nhiệt độ lớn hơn 30oC. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ trong khoảng 28-30oC để tiến hành nuôi cấy 2 chủng nấm men BM 32 và S51
3.2.3. Ảnh hưởng của SDS đến hàm lượng β-glucan trong vách tế bào nấm men
Bổ sung thêm SDS và EDTA vào môi trường ni cấy với mục đích kích thích sinh tổng hợp β-glucan đối với 2 chủng nấm men BM32 và S51. Tiếp tục nuôi cấy lắc ở 30oC trong 30 giờ. Hỗn dịch sau lên men được ly tâm, bỏ dịch nổi, sấy khô ở 80oC trong 4 giờ và định lượng β-glucan. Kết quả được mô tả trên đồ thị hình 3.4
Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của SDS đến hàm lượng β-glucan
Tại điểm không bổ sung SDS vào môi trường nuôi cấy, hàm lượng β-glucan thu được đối với chủng nấm men BM 32 là 10,2 %, chủng S51 là 9,88% và lượng β-glucan gần như không thay đổi khi bổ sung SDS vào với hàm lượng 30 pg/l. Chứng tỏ, khơng có sự tác động của SDS vào vách tế bào nấm men ở hàm lượng 30pg/l. Tuy nhiên, hàm lượng β-glucan tăng khá rõ khi hàm lượng SDS bổ sung là 60 đến 80 pg/l . Cụ thể, khi bổ sung SDS hàm lượng 60pg/l, phần trăm β-glucan thu được đối với chủng BM 32 là 11,4%, đối với chủng S51 là 11,2%. Khi bổ sung SDS 80 pg/l hàm lượng β-glucan định lượng được 11,5 % ở chủng BM 32 và tăng lên 12,0% ở chủng S51. Tiếp tục tăng hàm lượng SDS bổ sung vào môi trường lên 100 pg/l chúng tơi nhận thấy hàm lượng β-glucan khơng có sự thay đổi rõ rệt, thậm chí phần trăm β-glucan có sự giảm nhẹ ở chủng S51 (11%). Hàm lượng β-glucan giảm rõ rệt khi tăng hàm lượng SDS lên 120 và 150 pg/l. Chứng tỏ, khi hàm lượng SDS bổ sung lớn sẽ ức chế một phần sự sinh trưởng của tế bào nấm men dẫn đến sự giảm của hàm lượng β-glucan. Điều này hoàn toàn phù hợp khi so sánh với nghiên cứu của Naruemonvà cộng sự (2013) khi ông bổ sung thêm SDS hàm lượng 100pg/l vào môi trường nuôi cấy, hàm lượng β-glucan thu đượctăngtừ 7-40% so với ban đầu[20].
3.2.4. Ảnh hưởng của EDTA đến hàm lượng β-glucan trong vách tế bào nấmmen men
Tiếp tục bổ sung thêm EDTA vào môi trường nuôi cấy hai chủng nấm men BM 32 và S51 để lựa chọn hàm lượng thích hợp nhất kích thích sinh tổng hợp β- glucan. Dung dịch EDTA cũng được chuẩn bị dưới dạng dung dịch gốc 100 µg/ml. Thêm dung dịch gốc EDTA này vào 100ml môi trường MT4 với hàm lượng thay đổi như bảng 10. Nuôi lắc ở 30oC trong 30 giờ. Hỗn dịch sau lên men được ly tâm, bỏ dịch nổi, sấy khô sinh khối nấm men ở 80oC trong 4 giờ và định lượng betaglucan sử dụng bộ kit megazyme.
Hình 3.4. Hàm lượng β-glucan khi bổ sung thêm EDTA vào môi trường
Hàm lượng β-glucan khi không bổ sung thêm chất ức chế đối với cả 2 chủng nấm men nghiên cứu xấp xỉ 10%. Tiến hành bổ sung EDTA vào môi trường nuôi cấy nấm men với hàm lượng tăng dần 30; 60; 80; 100; 120; 150 pg/l. EDTA có ảnh hưởng khá rõ đến hàm lượng β-glucan đối với 2 chủng nấm men BM 32 và S51 khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Ở hàm lượng EDTA bổ sung là 30pg/l, hàm lượng β-glucan chưa có sự thay đổi nhiều so với mẫu không bổ sung EDTA, hàm lượng β-glucan định lượng được ở mẫu này vẫn khoảng 10%, cụ thể đối với chủng BM 32 hàm lượng β-glucan là 9,8% chủng S51 hàm lượng β-glucan là 10,24%.
Hàm lượng β-glucan thu được khá cao khi EDTA bổ sung 60-80 pg/l. Tuy nhiên, hàm lượng β-glucan thu được cao nhất khi tiếp tục tăng lượng EDTA bổ sung lên 100 pg/l. Ở nồng độ này, hàm lượng β-glucan thu được ở cả 2 chủng nấm men nghiên cứu tăng xấp xỉ 20% so với mẫu đối chứng không bổ sung thêm EDTA, đối với chủng nấm men S51 hàm lượngβ-glucan định lượng được là 12,37% và chủng BM 32 thu được là 13,2%. Tuy nhiên, lượng β-glucan bị giảm nhẹ khi tiếp tục tăng nồng độ EDTA bổ sung lên 120 pg/l. Ở nồng bộ bổ sung EDTA này, lượng β- glucan định lượng được lần lượt với các chủng S51 và BM 32 là 11,1 và 9,5%, giảm 20% so với mẫu bổ sung EDTA thích hợp nhất (120pg/l)và gần như khơng thay đổi so với mẫu đối chứng khơng thêm EDTA. EDTA có tác dụng kích thích sinh tổng hợp β-glucan ở nồng độ nhất định.
3.2.5. Bổ sung thêm hỗn hợp SDS và EDTA.
Nghiên cứu bổ sung hỗn hợp chất ức chế SDS và EDTA vào môi trường nuôi cấy để lựa chọn môi trường ni cấy có thành phần thích hợp nhất cho sinh tổng hợp β-glucan ở 2 chủng nấm men BM 32 và S51. SDS và EDTA bổ sung vào môi trường MT4 với tỉ lệ theo bảng 2.1. Cấy 5% giống cấy, nuôi cấy ở 30oC trong 30 giờ, sau đó, thu sinh khối, sấy khơ ở 80oC trong 4 giờ, định lượng β-glucan, thí nghiệm lặp lại 3 lần, hàm lượng β-glucan trung bình được trình bày ở đồ thị bên dưới.
Hàmlượng β-glucan định lượng được ở 2 chủng nấm men BM 32 và S51 ở các điểm bổ sung hỗn hợp SDS và EDTA có sự khác nhau rõ rệt. Hàm lượng β-glucan cao nhất thu được ở các thí nghiệm H9 (SDS: 80pg/l; EDTA: 60 pg/l), H15 (SDS:80 pg/l; EDTA: 80 pg/l) , H20 (SDS: 100 pg/l; 60 pg/l) ở chủng BM 32, β- glucan định lượng được ở chủng này tương ứng lần lượt là 15,2; 14,7 và 14,4% tăng xấp xỉ 25% so với mẫu đối chứng là mẫu không thêm SDS và EDTA và môi trường nuôi cấy.
Bảng 3.5. Hàm lượng β-glucan khi bổ sung SDS và EDTA vào môi trườngSTT STT Hàm lượng β-glucan (%) S51 BM 32 STT S51 BM 32 STT S51 BM 32 H1 10,2 9,88 H13 13,5 15,2 H25 11,3 12,8 H2 10,9 11,4 H14 12,1 13,4 H26 9,9 10,8 H3 14,7 15,3 H15 14,7 13,8 H27 10,9 9,8 H4 11,3 13,8 H16 11,4 10,7 H28 8,6 6,7 H5 8,8 7,3 H17 6,3 6,7 H29 7,4 5,2 H6 11,4 12,1 H18 5,2 4,1 H30 5,8 5 H7 12,1 11,9 H19 13,5 13,2 H31 10,2 10,6 H8 14,5 12,1 H20 14,4 12,5 H32 7,8 8,9 H9 15,2 14,2 H21 12,4 13,7 H33 7,9 9 H10 8,9 10,6 H22 7,8 9,3 H34 6,3 7,8 H11 6,3 8,7 H23 5,1 6,2 H35 5,3 6,3 H12 6,1 5,5 H24 5,3 5,5 H36 6,4 4,5
Đối với chủng S51, điểm bổ sung SDS và EDTA thu được lượng β-glucan cao nhất là H3 (SDS: 80 pg/l; EDTA; 30 pg/l); H9 (SDS: 80 pg/l; SDS: 60 pg/l) và H13 (SDS: 30 pg/l; EDTA: 80 pg/l) với lượng β-glucan định lượng được lần lượt là 15,3; 14,2 và 15,2%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ chất ức chế lên mức 120 pg/l chúng tơi nhận thấy có sự giảm về hàm lượng β-glucan ở cả 2 chủng nấm men nghiên cứu. Khi bổ sung hỗn hợp chất ức chế ở hàm lượng thích hợp, lượng β- glucan ở chủng BM 32 tăng lên 10-12 %, chủng nấm men S51 tăng lên 10-15% so với khi bổ sung chất ức chế dạng đơn. Chúng tôi lựa chọn bổ sung hỗn hợp SDS: 80pg/l; EDTA: 60 pg/l đối với chủng BM 32 và SDS: 80pg/l; EDTA: 30 pg/l đối với chủng S51 vào mơi trường ni cấy để kích thích sinh tổng hợp β-glucan cho 2 chủng nấm men nghiên cứu.
3.2.6. Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp thu nấm men giàu β-glucan
Ni cấy 2 chủng nấm men trong bình tam giác chứa 100 ml mơi trường MT4 có bổ sung hỗn hợp SDS và EDTA với hàm lượng SDS: 80pg/l; EDTA: 60 pg/l đối với chủng BM 32 và SDS: 80pg/l; EDTA: 30 pg/l, nuôi cấy với khoảng thời gian 24; 30; 36; 40; 48; 72 giờ, sau đó, ly tâm thu sinh khối nấm men, sấy khô, định lượng β- glucan. Hàm lượng β-glucan thu được của 2 chủng nấm men nghiên cứu được mô tả ở đồ thị bên dưới
Hình 3.5. Đồ thị khảo sát thời gian thích hợp cho ni cấy nấm men BM 32 và S51
Trong 24 giờ đầu, lượng β-glucan định lượng được không cao, lượng β-glucan bắt đầu tăng lên khi kéo dài thời gian nuôi cấy lên 30 giờ (β-glucan chủng BM 32 đạt 14,6; β-glucan chủng S51 là 15,5%) lượng β-glucan tiếp tục tăng lên khi kéo dài thời gian nuôi cấy lên 36 và 40 giờ và ổn định ở mức xấp xỉ 17% đối với chủng BM 32 và xấp xỉ 16% đối với chủng S51. Khi kéo dài thời gian ni cấy lên 48 giờ và 72 giờ, thấy có sự giảm nhẹ của hàm lượng β-glucan định lượng được. Khi đó nấm men ở pha cuối của q trình sinh trưởng, nấm men bị chết đi ảnh hưởng đến lượng β-glucan thu được. Chúng tơi lựa chọn thời gian thích hợp cho nuôi cấy thu β- glucan từ 36-40 giờ.
3.3. NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU HỒI VÁCH TẾ BÀO NẤM MEN GIÀU Β-GLUCAN
2 chủng nấm men BM 32 và S51 được nuôi cấy trong bình tam giác 2 lít chứa 1,5 lít mơi trường MT4, ủ lắc ở 30oC. Sau 30 giờ, thu dịch nuôi cấy nấm men, chia vào các ống falcon 50, mỗi ống 50 ml, ly tâm loại bỏ dịch nổi, phần sinh khối nấm men được sử dụng để tiến hành nghiên cứu phương pháp phá vách tế bào nấm men.
3.3.1. Phá tế bào nấm men bằng kiềm nhiệt
Thêm 5 ml NaOH nồng độ thay đổi: 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 N, lắc đều ở 50oC trong thời gian 24; 36; 48 giờ. Định lượng protein ở hỗn dịch sau xử lý để đánh giá khả năng phá tế bào nấm men. Kết quả định lượng protein trung bình được mơ tả ở bảng dưới.
Bảng 3.6. Hàm lượng protein khi phá tế bào nấm men sử dụng kiềm nhiệt
Hàm lượng protein mg/ml Hàm lượng protein mg/ml NaOH (M) Chủng BM 32 Chủng S51
24 giờ 36 giờ 48 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ
0,05 0,3 0,8 1,6 0,2 0,5 0,7
0,1 1,8 2,1 2,4 1,3 2,4 2,5
0,2 2,6 2,8 3,5 2,1 2,8 3,3
0,5 2,1 3,4 3,42 2,4 2,7 3
Hàm lượng protein thu được khi xử lý nấm men nồng độ NaOH 0,05M trong 24 giờ không cao, đạt 0,3 mg/ml ở chủng nấm men BM 32 và 0,2 mg/ml ở chủng nấm men S51. Khi kéo dài thời gian xử lý kiềm nhiệt lên 24 và 36 giờ, lượng protein địnhlượng được cũng tăng nhưng không nhiều, chứng tỏ nồng độ kiềm 0,05M chưa thích hợp cho phá tế bào nấm men. Chúng tôi tiếp tục xử lý sinh khối 2 chủng nấm men với kiềm nồng độ 0,1; 0,2 và 0,5M và nhận thấy lượng protein tăng lên khi dùng kiềm 0,1M, ở 24 giờ, lượng protein định lượng được ở chủng BM 32 là
1,8 mg/ml, ở chủng S51 là 1,3 mg/ml. Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian xử lý, lượng protein định lượng được tăng lên khoảng 30% ở chủng BM 32 và 45% ở chủng S51. Hàm lượng protein tạo thành lớn nhất khi xử lý kiềm nhiệt nồng độ 0,2M trong thời gian 36 giờ (chủng BM 32 lượng protein định lượng được là 3,5 mg/ml, chủng S51 lượng protein định lượng được là 3,3 mg/ml). Hàm lượng protein không tăng lên khi chúng tôi tăng nồng độ kiềm xử lý lên 0,5M .
Hình 3.6. Phá tế bào nấm men chủng BM 32 bằng NaOH 0,2M sau 36 giờ ủ 50ºC
Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử SEM cho thấy hỗn dịch sinh khối nấm men sau xử lý bằng kiềm nhiệt ở thời gian 36 giờ còn khá nhiều tế bào nấm men nguyên vẹn (vị trí B). NaOH 0,2 M có khả năng phá vỡ tế bào nấm men tuy nhiên mất nhiều thời gian nhưng hiệu suất phá tế bào không cao. Sử dụng kiềm nhiệt phá tế bào thu vách nấm men giàu β-glucan cần thời gian xử lý lâu, lượng kiềm sử dụng là khá lớn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phá tế bào nấm men thu vách giàu β-glucan bằng phương pháp enzyme với mục đích giảm thời gian và lượng kiềm xử lý.
3.3.2. Phá tế bào nấm men bằng enzyme
Thêm 5 ml đệm phosphat pH 6,0 vào các ống fancon chứa sẵn sinh khối nấm men đã chuẩn bị như trên, thả các ống fancon này vàobể cách thủy đang sôi trong 5 phút, sau 5 phút lấy ra, làm nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung thêm 0,5 mg chitinase và protease hàm lượng theo bảng 4. Sau đó, ủ lắc trong tủ ấm ở 40oC, thời gian thay đổi 2; 4; 6; 8; 10 giờ. Hàm lượng protein của hỗn dịch sau xử lý enzyme được
Bảng3.7. Hàm lượng protein khi phá tế bào nấm men BM32 và S51 bằng enzyme STT S51 BM 32 STTHàm lượng protein (mg/ml)S51 BM 32 STT S51 BM 32 E1 4,33 5,2 E10 13,5 13,7 E19 12,3 12,9 E2 6,1 5,77 E11 8,8 9,6 E20 13,2 12,4 E3 6,9 7,8 E12 12,3 11,8 E21 5,6 6,3 E4 8,2 8,5 E13 13 14 E22 9,5 8,6 E5 9,6 8,9 E14 13,5 13,9 E23 13,4 14,1 E6 4,78 6 E15 11,6 12,7 E24 13,6 14,2 E7 8,5 9,2 E16 5,6 7,3 E25 14,1 13,8 E8 10,2 11,3 E17 10,2 9,8 E9 11,6 11,8 E18 13,2 12,7